马驽巴贝斯虫病检测方法PCR法编制说明

1马驽巴贝斯虫病检测PCR法编制说明一、工作简况根据内蒙古自治区市场监督管理局《内蒙古市场监督管理局下达的2020年第2批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划汇总表》，编号为25，题目为“马驽巴贝斯虫病检测方法PCR法”的计划任务，二连海关牵头成立由相关领域的专业技术人员和具有标准化专业知识的人员组成的标准起草组，组织实施该标准的制定。起草单位：二连海关技术中心，内蒙古自治区市场监督管理评审查验中心。主要起草人：陈少博、杨帆、王伊琴、包勇敢、荆文魁、常鸿，腾克。二、项目的意义和必要性马驽巴贝斯虫病属于马梨形虫病的一种，是寄生于马、驴、骡、斑马等马属动物红细胞内的血液原虫引起。被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告检疫疫病，在我国被列为二类动物疫病。该病在欧洲南部地区、中东地区、非洲、亚洲、南美洲均有发生，广泛存在于世界各地；在我国，吉林、新疆、甘肃、河北、广东、贵州等省份均有报道，基本遍布全国，发病率从20%-77.6%不等。蜱虫是该病最主要的中间2宿主，也是马驽巴贝斯虫病的主要传播者。该病临床表现为体温升高，精神沉郁，肌肉振颤，呼吸和脉搏加速等症状，慢性病例耐过后体内会长期带虫，急性病例严重时会发生死内蒙古地区幅员辽阔，草原面积大，是我国最重要的马养殖畜牧大省之一。但是，该病的发病率在我区逐年上升，严重制约了我区马产业的发展，造成了巨大的经济损失。由于该病的临床症状与其他疾病相似，一些病例无显著临床症状，使得用临床检查很难准确的诊断出病因。该病的主要实验室检测手段有血涂片镜检、补体结合试验、ELISA试验、以及PCR试验等方法，几种方法各有其优缺点，血涂片镜检适合急性感染期的动物，对于虫体感染数量少或慢性感染的动物检出率都不高；补体结合试验和ELISA试验主要检测动物血清中抗体，且感染初期，抗体水平较低时容易漏检；但是，PCR检测因其直接检测病原核酸而非抗体这一特性，能有效的解决上述问题的不足。目前，PCR技术在疫病检测当中相当普及，PCR检测因其特异性较强、灵敏度高、大通量等特点，广泛应用于动物疫病中病原的直接检测。经查阅相关资料得知，关于马努巴贝斯虫病的诊断技术标准仅有一个出入境行业标准，该标准中涉及血液涂片镜检，补体结合试验和ELISA试验等常规检3测手段，但是并未提到PCR检测方法，这是该标准唯一不足的地方。因此，有必要结合以上方法的优缺点，建立一种针对马驽巴贝斯虫病的PCR检测方法作为内蒙古自治区地方标准，同时，也是对现有标准的一个重要补充。三、标准的起草过程3.1前期工作项目申请人以及参加人员拥有丰富的科研经历，在动物疫病以及动物源性成分研究领域具备相应的学科专业知识和实验操作技能，能够顺利实施和完成本项目。项目主持人在动物源性成分检测方面开展了大量的工作，积累了较多的经验，应用普通PCR技术、实时荧光PCR技术开展检测鉴定及定量方法；并在动物基因多态性方面取得重大突破，有着应用分子生物学技术，检测动物疫病的技术优势。项目承担单位动物检疫实验室是区域性中心实验室，负责本地区及二连口岸检疫性动物疫病检验检疫。现有仪器设备共计100多台套，价值1000多万元人民币。目前，实验室所购置的仪器设备按照自动化、高效化、标准化、高精度化等方向的要求配置，力争达到国内先进水平。仪器设备包括BioRad凝胶成像系统、DNA凝胶电泳系统、倒置显微镜、荧光显微镜、低温培养箱、高速离心机、超速离心机、生物安全柜、酶标仪、液氮罐、基因扩增仪、7500荧光定量PCR4仪、全自动核酸提取系统、全自动基因测序仪等。目前已经构建了畜禽疫病分子生物学快速检测平台、动物源性成分检测平台。具备开展本项目的硬件设施条件。承担单位组织保障措施：承担单位二连海关发挥组织作用，通过有效的协调和管理，调动本单位和参加单位的有效资源，形成对项目强有力的支持。通过组织优秀的研究队伍，并通过中期总结会、专家研讨会等形式督促项目研究工作的顺利完成。3.2制订起草计划编写了内蒙古自治区地方标准项目建议书，申请制标计划。项目获批后，制定工作思路和技术路线。同时制定了标准的计划和安排。3.2.1根据试验研究，起草“马驽巴贝斯虫病检测PCR3.2.3.形成终稿，2021年5月-2021年8月；四、制定标准的原则和依据4部分：试验方法标准》的规则编写。还参照相关国家标准编写指南的要求。5五、标准内容的研究5.1标准的科学性5.1.1马驽巴贝斯虫目的基因序列的比对选择马驽巴贝斯虫Bc48基因，经过序列比对，选择高度保守的片段做为目的片段。5.1.2标准方法的特异性试验以同种方法提取等量的马巴贝斯虫、环形泰勒虫和健康马血DNA为模版，进行PCR及实时荧光PCR检测，检测其特5.1.3标准方法的灵敏性试验马驽巴贝斯虫DNA做10倍的系列稀释，分别进行PCR及实时荧光PCR试验，取6个梯度的NDA浓度，针对实时荧光PCR，以其对应的稀释倍数对数与Ct值做标准曲线。5.1.4标准方法的重复性试验模板进行重复性试验，每次试验设3次重复，共进行3次试验，计算批内和批间Ct值得变异系数。5.2标准的实用性：适用于马属动物寄生虫病马驽巴贝斯虫的检测，分别采用PCR和实时荧光PCR（Real-TimePCR）方法。5.3标准的可行性：该方法在人、机、料、法、环等各方面因素具备的条件6下均易实现。具体说就是具有分子生物学基础的技术人员的配备、荧光PCR仪、实验材料是分子生物学实验材料、方法是特异性好、灵敏度高、重复性好的PCR和实时荧光PCR方法、和具有分子生物学检测的实验室环境均可满足实施该标准方法的检测条件。5.4标准阳性对照的确定采用已知含马驽巴贝斯虫的血液样品，或经测序的阳性质粒。六.方法验证为验证本方法的有效性和适用性，选择3家相关科研或检测机构，对本方法进行验证，验证内容为方法的特异性和敏感性。3家验证单位进行的PCR及实时荧光PCR法验证结果均符合相关样品实际情况。七.重大意见分歧的处理依据和结果无八.国内外情况简要说明经查阅相关资料得知，关于马努巴贝斯虫病的诊断技术标准仅有一个出入境行业标准，该标准中涉及血液涂片镜检，补体结合试验和ELISA试验等常规检测手段，但是并未提到PCR检测方法，这是该标准唯一不足的地方。因此，有必要结合以上方法的优缺点，建立一种针对马驽巴贝斯虫病的PCR检测方法作为内蒙古自治区地方标准，同时，也是对现7有标准的一个重要补充。九.结论综上所述，本标准在制定过程中所涉及到的各项技术指标均经过方法学的验证，并切实可行，完全达到了编制标准的要求。十.标准草稿征求意见情况汇总表序号提出单位/专家采纳不采纳（说明原因）1建议对7.2.1样品的总DNA提取中虫体的准备进行描述。沈阳海关技术中心/耿庆华采纳21.所有规范性引用文件应在文件中有所提及。3.建议对照GB/T1.1-2020中相关要求修改全文格式。4.建议在文中适当位置增加“生物安全措施或要求”呼和浩特海关技术中心/赵治国采纳3针”名称分别与7.1.2、7.