DB34∕T 2723-2016 农田杂草马唐对草甘膦抗性检测技术规程

农田杂草马唐对草甘膦抗性检测技术规程ofofpracticefordetectionofglyphosate-resistantcrabgrass(DigitariaSanguinalisHYPERLINK27发布2016-09-2016-10-27实施27发布安徽省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业委员会提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院棉花研究所、中国农业科学院棉花研究所。本标准主要起草人：李淑英、朱加保、路献勇、程福如、马艳、马小艳、郑曙峰、刘方志。1农田杂草马唐对草甘膦抗性检测技术规程本标准规定了农田杂草马唐(DigitariaSanguinalis(L.)Scop.)对除草剂草甘膦抗性的基本检测方法。本标准适用于农田禾本科杂草对除草剂草甘膦抗性的监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。培养皿测定法PetriDishScreeningAssay.将杂草种子平铺于加有不同浓度梯度草甘膦的培养皿内，通过测定草甘膦对杂草种子的发芽率、胚根长、胚芽鞘长的影响而进行的生物测定方法。整株植物测定法Wholeplantpotassays将杂草种子盆栽，在适宜温湿度条件下培养。当杂草培养到适宜时期，设置不同剂量草甘膦对杂草进行茎叶处理，通过测定草甘膦对杂草生物量的影响而进行的生物测定方法。3.3莽草酸测定法ShikimicAcidBioassaywithWholePlants将杂草种子盆栽，在适宜温湿度条件下培养。当杂草培养到适宜时期，设置不同剂量草甘膦对杂草进行茎叶处理，通过测定草甘膦对杂草体内莽草酸累积量的影响而进行的生物测定方法。胚根长度从与种子连接处到胚根顶端。2——量取30mLTritonX4.80.3%高锰酸钾4.101mol/L氢氧化钠4.120.1%高碘酸5.1电子天平(感量0.1mg);5.11量筒(100mL,250mL,500mL,1000mL);5.12离心管(1.5mL,2mL,10mL);35.15光照培养箱；5.16人工气候箱：——设定温度为白天30℃黑夜25℃、相对湿度(RH)60±10%、光照周期12h:12h(L:D)。6生物试材6.1试验土壤采用有机质含量≤3%、pH中性、通透性良好、过筛的风干壤土，试验前在120℃干燥箱内烘6h,灭活土壤内杂草种子。6.2杂草种子采集各试验样点成熟的马唐种子。经过挑选以后将种子放入牛皮纸袋中晾干，保证种子发芽率在80%以上，放置于4℃低温冰箱中保存。种子的田间采集区域不小于100m×50m,每隔20Km取样1次，然后将每个地区或县域内所取样本混合保存。同时在没有施用过草甘膦地区采集马唐种子，作为敏感对照。7试验步骤7.1杂草种子处理首先将供试马唐种子用质量分数为0.3%的高锰酸钾溶液浸泡消毒10min,用无菌水清洗3次。然后在9cm培养皿内放2层滤纸，每皿放入50粒马唐种子，置于光照培养箱内催芽，培养周期和温度设为白天30℃12h、黑夜25℃12h,当种子露白时待用。7.2杂草幼苗处理试验土壤定量装至盆钵的4/5处。采用盆钵底部渗灌方式，使土壤完全湿润。将预处理的供试杂草种子均匀撒播于土壤表面，覆土0.5～1.0cm左右，播种后移入人工气候箱常规培养。以盆钵底部渗灌方式补水。杂草出苗后进行间苗，当马唐长至3-4叶期时定苗，每钵保留长势一致的10棵幼苗。7.3药液配制rOCN准确称取一定量的草甘膦原药，痈丙酮或其它合适的有机溶剂溶解，并加夾10%(m/v)用量的TritonX-100,配制成母液备用。7.4处理方法7.4.1培养皿测定法选20粒经预处理露白的马唐种子均匀摆放于垫有2张滤纸的培养皿(直径9cm)内，种子的胚根与胚芽的方向要保持一致。将草甘膦母液用0.1%TritonX-100水溶液按照等比梯度配制成5-7个系列浓度，向培养皿内加入5mL系列浓度的草甘膦药液，使种子充分浸入药液中，每处理设6次重复，并设不含药剂的Triton水溶液作空白对照。4将处理后的培养皿置于光照培养箱内，在12h光照30℃、12h黑暗25℃的条件下培养。同时保持培养皿内湿润。7.4.2整株植物测定法标定喷雾设备参数(喷雾压力和喷头类型),校正喷液量；当马唐长到株高10-15cm(4-6叶、2-3个分蘖)时，将草甘膦母液用0.1%TritonX-100水溶液按照等比梯度配制成9-11个系列浓度，按试验设计从低剂量到高剂量顺序进行喷雾处理。每处理设6次重复，并设不含药剂的处理作空白对照。处理后待试材表面药液自然风干，移入人工气候箱常规培养。以盆钵底部渗灌方法补水。7.4.3莽草酸测定法马唐幼苗的药剂处理方法同整株植物测定法。喷药6d后剪取马唐植株上部茎叶(倒2、倒3叶)待用。首先称取新鲜叶片(0.45g-1.25g)加液氮充分研磨，然后按1g新鲜组织加4mL0.25mol/LHCl再次研磨；研磨后放入10mL离心管中平衡后10000g、4℃离心15min。取200μL离心上清液加入2mL0.1%高碘酸，于37℃温浴2.5-3h,以充分氧化莽草酸；然后加入2mL1mol/LNaOH和1.2mL0.1mol/L甘氨酸充分混匀，终止反应；最后用紫外可见光分光光度计在380nm处测定吸光度。每克新鲜组织的莽草酸积累量用莽草酸的标准曲线标定。莽草酸标准曲线：将莽草酸标准样品10.0mg溶于1.0mL0.25mol/LHCl中，分别从中取0、酸稀释液加入2mL0.1%高碘酸，于37℃温浴2.5-3h,以充分氧化莽草酸；然后加入2mL1mol/LNaOH和1.2mL0.1mol/L甘氨酸充分混匀，终止反应；于紫外可见光分光光度计380nm处测定吸光度。通过回归分析建立莽草酸标准曲线方程。7.5结果调查培养皿测定法在草甘膦处理后7d测量马唐胚根和胚芽鞘的长度。整株植物测定法在施药后7d记录每个剂量处理的马唐症状级别(见表1),并于施药后14d剪取地上部分称量鲜重，然后放入干燥箱内，经70℃48h烘干后称取干重。采用莽草酸测定法获得不同浓度药剂处理后马唐体内莽草酸的累积量。表1/草甘膦对马唐毒害症状分级标准级别01心叶轻微萎蔫2叶片从叶尖开始红褐化卷曲，部分叶片出现枯斑，枯叶面积为203部分叶片红褐花卷曲，植株整体褪绿红褐化，枯叶面积为40%～70%,植4植株叶片红褐化严重，枯叶面积达到70%以上，植株萎蔫，生长停滞。5植株严重萎蔫，枯死面积达到95%以上，或整株死8数据统计与分析58.1.1根据培养皿测定法调查数据，按公式(1)计算各药剂处理的胚根长或胚芽鞘长占空白对照的生长百分率(%),计算结果保留小数点后两位。R=L₁/Lo×100.......................................(1)R——生长百分率(%);Lo——对照马唐胚根长(或胚芽鞘长)(mm);L₁——处理马唐胚根长(或胚芽鞘长)(mm)。8.1.2根据整株植物测定法调查数据，按公式(2)计算施药后马唐的药害反应的药害综合指数I(%)。I=Z(每钵各毒害级别杂草株数×毒害级别)/(每钵总杂草数×最高毒害级别)×100%.....(2)8.1.3根据调查数据，按公式(3)计算各药剂处理马唐的干重占空白对照的干重百分率。R=G/Go×100%.................................R——干重百分率(%);Go——对照马唐干重(g);G₁——各处理马唐干重(g)。8.2.1用DPS(数据处理系统)、SAS(统计分析系统)或SPSS(社会科学统计程序)标准统计软件按公式(4)对药剂浓度与生长百分率R、药害综合指数I或干重百分率R进行非线性回归分析，计算EDso、EDo值及95%置信限。R——生长百分率或干重百分率R;I——药害综合指数X——草甘膦浓度(mg/L);D——低浓度草甘膦处理下杂草生长百分率；8.2.2用DPS(数据处理系统)交SAS(统计分析系统)或SPSS或社会科学统诛程序)标准统计软件按公式(5)对药剂浓度与莽草酸积累量进行非线性回归分析，计算EDo、ED9o值及95%置信限。U=D+(C-D)/[1+exp[b×(logx-logEDso)]]......................x——草甘膦浓度(mg/L);D——当草甘膦浓度为0时莽草酸积累量；ED₅o——当莽草酸积累量达C与D之间的50%时的草甘膦浓度(mg/L);69抗药性水平的计算与评估9.1抗性倍数的计算根据敏感杂草生物型的ED₅o值和测试杂草生物型的ED₅o值，按公式(6)计算测试种群的抗性倍RR=T/S