双歧杆菌在家畜疾病防治中的研究与应用

双歧杆菌（Bifidobacterium）是由Tissier首次从母乳喂养的婴儿粪便中分离，隶属于放线菌门放线菌纲双歧杆菌目双歧杆菌科双歧杆菌属。双歧杆菌是人和动物肠道的优势菌群，其丰度受年龄、健康状况和饲喂方式等因素影响。在家畜幼龄时期，双歧杆菌丰度较高，随着年龄增加，丰度逐渐降低。双歧杆菌可与病原微生物竞争肠道内的营养物质，或通过与其他微生物菌群互作来抑制病原菌的增殖和粘附，或通过诱导宿主免疫应答来维持肠道内环境的稳定，从而改善肠道健康。双歧杆菌是人和动物肠道疾病防治和食品科学领域研究的热点，近年研究表明，双歧杆菌在改善人和动物健康过程中发挥至关重要的作用。目前双歧杆菌制剂已经广泛应用于食品、美容保健、医药、饲料添加剂等领域，在动物疾病防治中也得到了广泛应用。双歧杆菌可改善家畜肠道健康、提高饲料转化率、调节机体免疫功能等。本文就双歧杆菌的种属分类、在家畜疾病防治防治中的作用机理及研究和应用进行综述，为双歧杆菌的开发和利用提供依据。1双歧杆菌的种属分类1.1双歧杆菌的生物学特性双歧杆菌为革兰阳性菌，无运动性、不产孢、不耐酸、厌氧。双歧杆菌的生理特性包括过氧化氢酶阴性，对氧敏感，GC含量高，对生长条件要求苛刻，最适生长温度为37～41℃，最适生长pH为6.5～7.0。其菌落形态多光滑，有凹凸且完整的边缘，颜色为乳白色到白色；其细胞呈杆状，末端分叉呈V形或Y形。在不利的生长条件下，其细胞形态表现出高度的多形性。研究表明，培养基中的N-乙酰葡萄糖、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和Ca2+浓度等对双歧杆菌的细胞形态产生影响。双歧杆菌的碳水化合物分解代谢途径不同于乳酸菌的同型发酵或异型发酵，而是通过特殊的双歧支路代谢途径，即果糖-6-磷酸途径发酵，终产物为乙酸和乳酸，两者摩尔比为3:2，还产生少量的甲酸和乙醇，不产生CO2、丙酸和丁酸。上述代谢途径是由于双歧杆菌缺乏醛缩酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶而含有果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶（F6PPK），该酶在双歧杆菌支路代谢中发挥着重要作用，因此F6PPK基因也可以作为双歧杆菌分类鉴别的工具。1.2双歧杆菌分类根据《伯杰氏系统细菌学手册》（2012）中，双歧杆菌隶属于细菌域放线菌门放线菌纲双歧杆菌目双歧杆菌科双歧杆菌属。双歧杆菌属有32个种、9个亚种，来源于人类肠道、口腔、食物、动物胃肠道、昆虫肠道和污水等。最近，有相关文献报道从灵长类动物的粪便样本发现了新型双歧杆菌。动物源性菌株主要从猪、牛、羔羊、鸡、兔子等家畜禽的粪便中分离（见表1）。表1动物源性双歧杆菌分类和来源双歧杆菌传统分类和鉴定主要是依据表型方法，包括细胞形态、菌落形态、有无芽孢、运动性、革兰氏染色、营养需求、糖发酵、代谢产物等。该类方法不能将双歧杆菌与其他产乳酸细菌或乳酸杆菌完全区分开来。此外，有的双歧杆菌无法培养，其表型分析缺乏可靠和明确的结果。更重要的是，有些双歧杆菌菌株基因序列高度一致，但表型发生了变异。随着遗传学和分子生物学的迅猛发展，基于核酸基因型的方法也被广泛用于双歧杆菌的检测与鉴定。在细菌染色体中，16SrRNA，23SrRNA和5SrRNA基因较保守，其中16SrRNA基因普遍用于细菌的分类鉴定的依据，被认为是细菌分类鉴定的金标准。研究者普遍使用16SrRNA基因序列对双歧杆菌进行系统发育分析，此外，基于双歧杆菌16SrRNA基因序列设计的特异性PCR引物，还可用于双歧杆菌的快速鉴别和定量。相关研究表明双歧杆菌属的各个种或亚种的16SrRNA基因具有高度相似性，在鉴别双歧杆菌属内的各个种或亚种中的分辨率较低为了克服这些技术的局限性，与单基因相比，依赖于多个保守分子标记，例如clpC、dnaB、dnaG、dnaJ1、purF和rpoC基因，还有tuf、recA、hsp60、groEL、groES和编码苏氨酸-tRNA连接酶（thrS）的多基因方法被证明在物种区分及系统发育分析方面更可靠。但这些基因仅能应用于有限的物种。近年来，全基因组测序技术正在逐渐取代传统的微生物分型和表征方法，基于基因组水平可对双歧杆菌物种进行精确的分类、分型及系统发育分析，还可揭示了双歧杆菌代谢机制及其与相应宿主之间的联系。2双歧杆菌防治肠道疾病的作用机理双歧杆菌耐受过胃肠道不利因素后，与肠上皮细胞粘附并定植于大肠；双歧杆菌代谢产物、肠道微生物及宿主肠道相互作用，保护肠道上皮屏障，调控肠道微生态平衡，促进肠道健康。2.1双歧杆菌在肠道内的分布区域双歧杆菌在耐过胃肠道多种因素（如胃中的酸性pH值、胃酶、胆汁、胰酶）后，主要定植于哺乳动物的结肠。连续给大鼠灌胃长双歧杆菌BBMN687d后，采集粪便并检测其菌体情况，结果表明，长双歧杆菌BBMN68在胃和小肠中存活率均较低，在结肠和直肠中存活率较高并可在结肠中进行增殖，这是由于结肠可以分泌碳酸氢盐，使大肠液呈碱性（pH8.3～8.4），并且结肠中适宜温度及缓慢的运动给双歧杆菌提供了一个适宜的栖息场所，这与Taverniti等研究的结果一致。2.2双歧杆菌与肠道上皮细胞的相互作用肠上皮细胞是肠道黏膜屏障的重要组成部分，通过产生物理屏障及化学屏障将共生微生物和宿主免疫系统隔开，从而维持两者在肠道内的共生关系。另一方面，双歧杆菌是哺乳动物肠道中的共生菌，大部分附着于大肠的肠上皮细胞。双歧杆菌物种多样，即使同种双歧杆菌，粘附机制也存在显著的差异。在短双歧杆菌UCC2003中，IVb型紧密粘附菌毛（Tad）是一种重要且保守的宿主定植因子；转醛缩酶是两歧双歧杆菌表面蛋白质，具有粘蛋白结合蛋白的作用，即促进菌株对HT29细胞的粘附；两歧双歧杆菌ATCC15696胞外唾液酸酶与粘蛋白碳水化合物上唾液酸低聚糖和血型A抗原的α2,6键相互作用，增强了两歧双歧杆菌与黏膜表面的粘附；最近一项研究表明，由长双歧杆菌BBMN68菌毛产生的菌毛亚基蛋白（FimM）可作为一种新的表面粘附素，可介导BBMN68与粘蛋白、纤连蛋白和纤维蛋白原的粘附。双歧杆菌在粘附并定植于宿主肠道后，可促进肠道健康。双歧杆菌在猪肠上皮细胞系（PIE细胞）中的免疫调节活性研究表明，婴儿双歧杆菌MCC12和短双歧杆菌MCC1274能够增加PIE细胞中干扰素-β（IFN-β）的产生，以响应猪轮状病毒感染。同时，在轮状病毒感染之前用IFN-β治疗新生小牛和小猪，可抑制病毒复制并降低疾病严重程度。此外，两种双歧杆菌都增加了趋化因子（CXCL10）和白细胞介素（IL-6）的表达。这表明，双歧杆菌菌株通过模式识别受体信号来调节猪肠道上皮细胞的轮状病毒免疫反应。在另一项研究中，短双歧杆菌MCC-117能够有效调节猪肠上皮（PIE）细胞系中产肠毒素大肠杆菌（ETEC)引发的炎症反应。双歧杆菌还可刺激回肠上皮中Toll样受体2（TLR-2）和环氧化酶-2（COX-2）的表达并阻断细胞因子诱导的细胞凋亡，通过该分子机制减少黏膜损伤并保持肠道完整性。2.3双歧杆菌与肠道其他微生物的相互作用肠道菌群是一个包含多种微生物集合的自然环境。不同物种之间通过生长空间、结合受体位点、获取胃肠道营养资源的竞争等来决定了肠道微生物群的稳态。双歧杆菌通过菌株特异性拮抗机制竞争性排除病原体。长双歧杆菌长亚种和婴儿亚种可以通过阻止盲肠中志贺毒素的产生或志贺毒素从肠腔转移到血液中来防止大肠杆菌O157:H7的致命感染。嗜热双歧杆菌RBL67可导致沙门氏菌毒力基因表达失衡从而降低其对宿主的感染率，还可抑制沙门氏菌鞭毛基因的表达来降低其运动性从而抑制沙门氏菌的定植。饲喂双歧杆菌可改变宿主肠道菌群的组成。给小鼠灌胃两歧双歧杆菌MIMBb23sg5d后，对小鼠肠道进行微生物组进行分析。结果表明，两种阿克曼氏菌的丰度增加了。小型猪饲喂嗜热双歧杆菌RBL67和低聚果糖(FOS)发现，猪盲肠和结肠中双歧杆菌数量显着增加。一项研究评估了长双歧杆菌BB536对具有15种人类肠道微生物群的无菌小鼠肠道环境的调节作用。研究发现补充长双歧杆菌BB536菌株可改变肠道微生物群落结构，从而改变肠腔内生物素和丁酸盐的代谢。2.4双歧杆菌产生的生物活性物质与宿主相互作用双歧杆菌可产生短链脂肪酸、吲哚、细胞外囊泡、细胞外蛋白、细菌素等代谢产物，这些物质可抑制病原体粘附，保护肠道上皮屏障，并增强紧密连接的表达。短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物发酵膳食纤维和抗性淀粉的最终产物，包括醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐等，是维持肠道稳态的重要代谢物。首先，醋酸是肠道中最丰富的SCFA，由糖酵解产生的乙酰辅酶A产生；有研究表明，长双歧杆菌长亚种JCM1217T、长双歧杆菌婴儿亚种157F、长双歧杆菌长亚种NCC2705内的果糖及其ATP结合盒ABC型碳水化合物转运蛋白在很大程度上促成了醋酸盐的产生，醋酸盐在宿主结肠上皮细胞中介导抗凋亡和抗炎反应，从而保护小鼠免受O157诱导的死亡。丙酸盐作为肝脏糖异生的前体，影响细胞分化，对肠道炎症和癌症发展具有潜在的促进健康的作用。丁酸盐是结肠上皮细胞的首选能量来源，有助于维持肠道屏障功能，并具有免疫调节和抗炎特性。利用菊粉型果聚糖(ITF)和阿拉伯木聚糖低聚糖(AXOS)等益生元来刺激结肠中双歧杆菌的生长，同时也增加了结肠细菌中丁酸盐的产生。吲哚是含有色氨酸酶的细菌产生的，而肠道中共生微生物群有助于在肠腔中产生大量吲哚，该类物质可促进结肠内皮细胞中紧密连接和粘附连接相关分子的表达从而增强结肠上皮屏障功能。长双歧杆菌婴儿亚种利用人乳寡糖可产生色氨酸代谢物吲哚-3-乳酸(ILA)，吲哚-3-乳酸(ILA)通过激活肠上皮细胞中的芳烃受体(AhR)和下游核因子红细胞衍生2样2(Nrf2)通路来降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导促炎细胞因子白细胞介素-8（IL-8）的产生，从而降低肠上皮细胞的炎症。细胞外囊泡是由细菌释放的一种脂质双层纳米结构的细胞外颗粒，主要由蛋白质、核酸、脂质、脂多糖组成。一项研究中，两歧双歧杆菌LMG13195的细胞外囊泡可激活树突状细胞以促进调节性T细胞（Treg）细胞的分化并诱导比干扰素γ（IFNγ）、TNF-α和白细胞介素-17（IL-17）促炎细胞因子更高水平的白细胞介素-10（IL-10），结果表明双歧杆菌LMG13195细胞外囊泡可作为过敏原特异性免疫治疗的潜在佐剂。另一项研究证实了是由长双歧杆菌KACC91563胞外囊泡分泌的胞外溶质结合蛋白通过肥大细胞特异性凋亡有效缓解食物过敏症状。此外，长双歧杆菌NCC2705胞外囊泡还分泌粘蛋白结合蛋白，该蛋白可以粘附到宿主黏膜表面从而促进长双歧杆菌在胃肠道中的定植。细菌素是由核糖体合成的抗菌肽，可抑制肠道病原体，促进肠道健康。双歧杆菌细菌素具有潜在的重要意义和价值，但由于双歧杆菌培养时间、培养方式的影响，只有少数双歧杆菌细菌素进行深入研究。研究表明双歧杆菌素B由两歧双歧杆菌NCFB1454产生，对李斯特菌、肠球菌、葡萄球菌、梭菌和芽孢杆菌具有抗菌活性；婴儿双歧杆菌BCRC14602产生的双歧素I，其抗菌谱广，对革兰氏阳性细菌如链球菌、葡萄球菌和梭状芽孢杆菌，以及革兰氏阴性菌如沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌等具有抑制作用。2.5双歧杆菌调控肠道内稳态的可能机制双歧杆菌可调节肠道菌群平衡，KatoS等研究发现，两歧双歧杆菌G9-1能够抑制大肠杆菌的过度增殖并恢复空肠绒毛长度，改善菌群生态失调，进而缓解腹泻症状。另一研究也表明BBG9-1可显著抑制5-氟尿嘧啶诱导的小鼠肠道内厚壁菌门丰度的降低和拟杆菌门丰度的相应增加。这表明，BBG9-1通过减少生态失调来抑制继发性炎症，从而预防5-氟尿嘧啶诱导的肠道黏膜炎。最近一项研究发现，长双歧杆菌胞外分泌蛋白即长双歧杆菌溶菌酶样蛋白是一种抗菌肽，具有抗菌活性；通过16SrRNA基因高通量测序结果显示，经长双歧杆菌溶菌酶样蛋白处理后，厚壁菌门相对丰度增加而变形菌门的相对丰度降低。结果表明，长双歧杆菌溶菌酶样蛋白参与了肠道微生物群的调节。3双歧杆菌在家畜疾病防治中的研究和应用腹泻的发生可由病原微生物感染引起，同时，应激、日粮、卫生条件等因素也会改变胃肠道菌群结构，导致病原菌成为优势菌群，有益菌减少。在动物腹泻相关疾病的预防中，常在饲料添加剂中添加双歧杆菌等益生菌，提高动物饲料转化率、改善机体免疫、调节肠道微生态平衡。3.1防治畜禽腹泻腹泻是由于细菌、病毒、寄生虫等多种因素引起肠道感染的一种临床症状，可导致幼龄哺乳动物严重脱水、电解质紊乱并继发一系列的并发症后死亡，给畜牧业生产造成巨大的经济损失。CizeikieneD等研究发现B.pseudolongumDSM20099和B.animalisDSM20105菌株在发酵过程中产生乳酸、乙酸、抗菌肽等化合物，可降低细胞质的pH值从而抑制病原微生物的生长。同时，许多研究也表明,双歧杆菌可缓解产肠毒素大肠杆菌ETEC、鼠伤寒沙门菌引起的腹泻。KangJY等研究证明长双歧杆菌可增加干扰素IFN-α、IFN-β的水平和干扰素诱导型抗病毒效应物的基因表达从而在体外和体内有效抑制轮状病毒复制。另一项研究表明长双歧杆菌BORI细胞提取物中的低分子量和非蛋白质成分在抗轮状病毒作用中发挥重要作用。3.2促进畜禽的生长发育在动物腹泻相关疾病的预防中，许多研究表明，新生犊牛和仔猪口服假长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌或B.globosum可以使体重增加、提高饲料转化率并降低腹泻发生的频率及死亡率。Abdel-MoneimAE和El-MoneimAEEA的研究都评估了卵内注射双歧杆菌对肉鸡性能、回肠组织形态测定的影响，结果都表明所有治疗组的体重增加和饲料转化率都有显著改善及回肠组织形态中绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比值显着升高。大量文献也证明了双歧杆菌可以提高机体免疫力