高中生物拓展课件：原生质体的分离 高二上学期

原生质体的分离，融合，培养及复壁

给我一个活的细胞，我可以创造一个生物世界！

FrancoisVincent,Raspail

新生婴儿的细胞数目约为1012个；成年人的细胞数目约为2×1014个，约200种细胞。给出一个不是定义的定义---什么是细胞？

一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找！Wilson

1.一切植物和动物都是由细胞组成－－施旺和施莱登

2.细胞是生命活动完整实施的基本单位。

上述两项分别说明了生命个体与细胞的结构和功能关系细胞

细胞是多层次非线性的复杂结构体系

细胞具有高度复杂性和组织性

细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体

细胞完成各种化学反应

细胞需要和利用能量

细胞参与大量机械活动

细胞对刺激作出反应

细胞是高度有序的，具有自组装能力与自组织体系

细胞能进行自我调控

繁殖和传留后代原生质体定义

《辞海生物学分册》定义原生质：任何细胞和非细胞形态的生活物质都是由具有相似的基本组成成分和特性的“原生质”构成。

原生质体一词来源于原生质，即由质膜包围的裸露细胞，又称原生质球。植物细胞：脱去细胞壁、获得的裸露细胞，即其原生质体。动物细胞：一个动物细胞就是一小团原生质体。暴露于5%NaCl溶液中的发生质壁分离的植物细胞Sheenlab提取拟南芥原生质体原生质体作用

1、遗传转化的理想受体：由于没有细胞壁，原生质体可相对容易摄取DNA，染色体，细胞器，病毒等外源遗传物质。2、开辟杂种新途径：是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料，还可通过诱导形成杂种细胞。3、定向培养：将纯化后的原生质体转移到适当条件下，使原生质体适合于遗传转化、细胞融合、生理研究、体胚发生、器官发生等操作。原生质体培养在植物快速繁殖、植物远缘遗传重组、转基因以及品种改良和创造新品种等方面具有广阔的应用前景。人教版选修三实验原理介绍1、材料的选择和预处理2、原生质体分离3、原生质体纯化4、原生质体活力测定和计数5、影响原生质体数量和活力的因素6、原生质体培养方法7、影响原生质体培养的因素8、原生质体融合再生过程

起始材料及生理状态对原生质体的制备和其活力有很大影响。叶片可以大量获取并且能得到比较均一的原生质体，为最佳材料。此外，花期短的花瓣、根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织也可作为实验材料。

1、材料选择和预处理

材料的预处理可以改变细胞的生理状态，增加细胞膜的强度，达到提高分离的效率和减少原生质体损伤等。如在酶解前预先质壁分离处理，因为此时原生质体收缩封闭了胞间连丝，避免了细胞内容物的流失。

用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。

☆龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。

☆甘蔗植株在黑暗下培养12h后分离的原生质体才能分裂。

☆马铃薯试管苗叶片在黑暗下处理48h后分离原生质体才能获得高产量。

1、材料选择和预处理

分离方法分为机械分离法和酶解分离法。

机械分离法：使细胞处于高渗溶液环境下，待其发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，磨碎组织，使原生质体从伤口处流出。同时改变溶液浓度，使原生质体复原。酶解分离法：植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，利用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。植物细胞壁组成：纤维素（35-50%），半纤维素（25-30%）木质素（或果胶）（10-20%）2、原生质体分离

原生质体分离方法优缺点比较2、原生质体分离优点缺点机械分离法

避免酶制剂对原生质体的破坏作用获得量较少；能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。（细胞较大，高度液泡化）酶解分离法操作简单，获得量大，适用广泛商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，会影响所获原生质体的活力优缺点分离方法

原生质体纯化方法主要有离心沉淀法、漂浮法、界面法等，其原理都是利用原生质体和杂质比重不同而进行分层。沉降法利用比重原理，在一定的渗透压溶液内低速离心，使完整的原生质体沉于试管底部。漂浮法用较原生质体比重大的渗透压较高的溶液，使原生质体漂浮于溶液表面。界面法用两种比重不同的溶液，使健康和完整的原生质体处于两液相的界面之中。3、原生质体纯化

形态识别：形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。

FDA(荧光素二乙酸)染色法：FDA本身无极性，无荧光，可自由出入细胞。但在活细胞中经过酯酶的催化，转化为荧光素。荧光素是荧光极性物质，不能自由出入细胞，在细胞内积累，而死细胞则不产生荧光素，不发出荧光。

4、原生质体活力测定和计数

台盼蓝染色法：完整细胞膜的排斥，没活力或者受损的细胞显蓝色，有活力的细胞不吸收染料为无色。CFW(酚藏花红)染色法：红色的为死的原生质体，活的原生质体不着色。观察胞质环流法：显微镜下观察具有胞质环流者为代谢旺盛的原生质体。氧电极法：用氧电极检测放氧速率来代表呼吸代谢，光合作用活力。原生质体存活率＝活的原生质体数/观察的原生质体总数

4、原生质体活力测定和计数

4、原生质体活力测定和计数

产量测定一般用血球计数板法。让滴出的原生质悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜(图8－3)。静置2min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃。计数时用虹彩、集光器、反光镜等调节入射光角度和强度，认清计数室位置。采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则(图8～4)。（1）供试材料及预处理方法。根据不同材料的不同性质，确定相应的预处理方式。（2）离心条件：离心次数、离心速度、离心时间。5、影响原生质体数量和活力的因素（3）

酶解条件：酶质量

、组合、渗透压、pH、浓度、光照和温度、持续时间等。

酶解液最好现配现用。酶解时，针对不同的取材会相应的添加一些其他酶或调整不同酶的浓度。如：分离根尖原生质体时加入崩溃酶，分离愈伤组织时加上半纤维素酶，从花粉中分离原生质体时加入蜗牛酶。5、影响原生质体数量和活力的因素（3）

酶解条件：酶质量、组合、渗透压、pH、浓度、光照和温度、持续时间等。

酶液的渗透压必须与处理细胞的渗透压相似。通常加入葡萄糖、甘露醇或者山梨醇等渗透剂调节。使用的浓度范围因材料而异，一般0.35-0.8

mol/L，pH值为5.4-5.8。MES(吗啉乙基磺酸)作为缓冲调节剂，可增加原生质体的释放量和原生质体的稳定性。5、影响原生质体数量和活力的因素6、原生质体培养方法培养方法液体浅层培养直接于培养液中培养固体培养与低熔点琼脂糖混合培养固液双层培养浅层培养于固体培养基之上看护培养浅层培养于含看护细胞的固体培养基之上琼脂糖培养与琼脂糖混合培养，混合液滴加于器皿底部，凝固后滴加液体培养基7、影响原生质体培养的因素（1）植物基因型同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所需要的条件不同，造成不同品种在相同条件下的再生能力也不尽相同。（2）原生质体初植密度合理调整培养密度，过大，易形成竞争空间养分；过小影响植板率（3）渗透压稳定剂（4）培养基配方（5）培养条件7、影响原生质体培养的因素培养液里有无机物，有机物，激素，固化剂以及其它。无机物包括N,

P,

S,

K,Ca,

Mg(大量元素),Cu,Fe,Zn,B,Mn,Mo有机物包括碳源，维生素，氨基酸，有机酸，肌醇，天然复合物。激素包括生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸等。固化剂有琼脂糖，琼脂等。其它的包括抗生素等。注意：葡萄糖为首选碳源，培养基中要除去铵（对原生质体存在有害），铁、锌也适当减少，钙浓度要增加2-4倍，为了改善膜稳定性。8、原生质体融合再生过程

通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交。

同核体：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞

异核体：不同基因型的杂交细胞。8、原生质体融合再生过程

根据是否人工诱导分为：自发融合和诱导融合自发融合率非常低，我们通常进行人工诱导。

诱导融合方法：物理方法（电击融合法）化学方法（聚乙二醇（PEG）细胞融合）生物方法（仙台病毒诱导细胞融合）人教版选修三电击细胞融合法细胞电融合原理:（1）通过双向电泳使细胞间的接触变得非常紧密:采用了高频交流电，诱导细胞去极化，引起细胞聚集，排列成串珠状，互相紧密接触;（2）然后给予短暂的高压脉冲，引起细胞膜的穿透，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两个细胞融合逐步完成。为了稳定这个过程，在短期内需要施加交流电压。（3）刚完成电融合的融合细胞可称为异核体，尽管表面的细胞膜已经发生了融合，细胞内仍可以看到两个或两个以上的细胞核。随后，细胞核也会在细胞内部发生融合。8、原生质体融合再生过程

聚乙二醇（PEG）细胞融合改良为PEG(聚乙二醇)高Ca2+高pH融合法。以PEG为融合剂的一种化学融合法，PEG与原生质体膜结合后引起膜结构紊乱，使得原生质体互相聚集，在高Ca2+高pH条件下，原生质体融合，完成融合过程。PEG在细胞融合中的作用：(1）促进细胞凝聚；（2）改变细胞膜结构，使两细胞接触点处的磷脂分子层的脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。8、原生质体融合再生过程仙台病毒诱导细胞融合：仙台病毒属于RNA病毒，直径为50-600μm，其质膜表面存在两种糖蛋白：一种是HANA蛋白，它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性；一种是F蛋白，它具有质膜融合能力、细胞融合能力和溶血能力。HANA蛋白使病毒吸附于细胞表面，并水解表面糖蛋白，F蛋白使两原生质体融合。

8、原生质体融合再生过程

经原生质体培养的植株再生一般经过细胞壁再生，细胞分裂成细胞团、愈伤组织（或胚状体）、植株再生这几个过程。细胞壁再生：原生质体在合适条件下（接种密度，碳源，激素以及光照等因素都影响其复壁率）短时间内开始膨胀，叶绿体重排，并开始合成新的细胞壁，进而由球形变成椭圆形。在原生质体培养过程中，多数细胞能再生壁，但不同材料复壁的迟缓期差异很大。蚕豆10

min就开始复壁，烟草8-10

h复壁，小麦6-10

h复壁，水稻24

h复壁。利用细胞融合技术观察蛋白质运动

利用细胞融合技术观察蛋白质运动单克隆抗体的制备原生质体的分离染色计数原生质体融合复壁具体实验操作（1）植株培养将野生型本氏烟播种于培养基质上，放入恒温培养箱培养(光/暗周期为16/8h,相对湿度80%,光照度6000lx)。

市场上购买的小青菜幼叶。（2）预处理去除小青菜与烟草叶背表皮；采用EP管管盖打孔取叶片2片（或取生长状态良好的叶片适量,切成0.5mm的细丝）,用预质壁分离液(组成为0.4mol/L甘露醇和10mmol/L氯化钙)分离1h。二、原生质体的分离染色计数（3）酶解加入10mL酶液(1%的纤维素酶R-10、0.25%的果胶酶、6.8

mM氯化钙、0.4M甘露醇,

pH5.5)。28(或37)℃对材料进行14h静置酶解。期间每半小时取出EP管，轻柔摇晃，促使酶液与材料充分接触；（4）纯化酶解结束后,依次用60目和100目的不锈钢网筛过滤原生质体溶液，滤去杂质,滤液分装入2mLEP管,在600

r/min的条件下,离心5min,弃上清,沿管壁加入洗液（MS培养基）后继续离心,如此重复1-3次，最后定容于0.5mL.。（沉降法）（5）计数

用血球计数板进行计数，计算4个角上大格及中央大格(共5个大格)内的原生质体数，然后按公式计算原生质体数，每个样品计数6个重复，最后计算出每克鲜重材料游离得到的原生质体产量。原生质体产量(个/g)=5个大格内总原生质体数/80×400×104×稀释倍数÷叶片质量(g)二、原生质体的分离染色计数（6)活力检测

取一滴EP管中下层原生质体溶液，置于光学显微镜下观察。二、原生质体的分离染色计数二、原生质体的分离染色计数撕去下表皮酶解前后10倍镜下的原生质体40倍镜下的原生质体三、原生质体融合复壁

参考王金发等编撰的《细胞生物学实验教程（第二版）》(1)取一干净离心管，轻柔加入烟草原生质体0.1ml，再沿管壁逐滴加入小青菜原生质体0.1ml；

(2)静置10-15min，使原生质体贴于管底或管壁。(3)用吸管吸取PEG3350溶液，等体积（0.2ml）缓慢加于原生质体液面上，静置10—15min。在显微镜下观察原生质体粘连情况。(4)用吸管向原生质体液滴中慢慢加入高pH高钙洗涤稀释液3次，每次0.5mL，每次间隔5

min。(5)600rpm离心5min，弃上清，再缓慢加入2mL高pH高钙洗涤稀释液，5min后再次离心；。(6)

弃上清，用MS培养基如上换洗两次，加入1mLMS培养基，盖上管，置于26℃培养24h，再转到弱光下培养。三、原生质体融合复壁(7)观察融合复壁过程。取一滴原生质体悬浮液滴在载玻片上，用光学显微镜观察。培养两周后，可以发展成细胞团。这时应该添加新鲜培养基，渗透压减半。一般培养24h后可以观察到再生细胞壁。三、原生质体融合复壁

理论课加实验课，理论课讲解实验原理知识。设置两次实验课。主要以体验实验过程，运用理论知识分析实验结果为主。1、原生质体的分离染色计数，在酶解等待时可以介绍廖嘉明等人所做实验的实验步骤。让同学们和自己所做的实验进行对比，对实验结果形成原因进行分析和提出实验改进。2、原生质体融合复壁实验关键是让学生观察复壁的过程，以及意识到分离纯化原生质体对该实验的影响。四、课程安排五、几种细胞融合的成功例子人教版选修三题目

（2015浙江宁波市鄞州中学测试）科学家以番茄（2N）和马铃薯（4N）为材料利用下图技术得到“番茄-马铃薯”植株．请回答下列问题：（1）获得a,b所选用的酶为

，c,d的名称依次是，

。（2）图示技术名称是

；由d培育成植株的过程运用的技术手段是

，其依据的原理是。（3）过程称为，所用的化学诱导剂一般是，过程成功的标志是。（4）过程④是，⑤过程增值的方式为。诱导f中植株生根过程中培养基中生长素与细胞分裂素的比较值较④过程

（高/低）；最终获得的“番茄-马铃薯属于”

倍体植株。

纤维素酶和果胶酶植物细胞全能性PEG(聚乙二醇)植物体细胞杂交技术原生质体融合脱分化（形成新细胞壁）杂种细胞原生质的培养杂种细胞再生细胞壁有丝分裂(正在融合的)原生质体高六题目

（2017浙江台州选考质检）某科研团队利用植物细胞工程技术，把基因序列已知的抗除草剂（Bar）基因导入原生质体获得抗除草剂大豆。请回答下列相关问题：

(1)对于已获得的Bar基因可以用

技术进行扩增。图中的a过程通常使用相同的

酶和DNA连接酶，使目的基因与载体连接形成重组DNA。(2)在b过程中，获得原生质体除了需要纤维素酶和果胶酶，还需要用到的试剂是

。(3)成功导入重组DNA的原生质体经脱分化形成I

,进而生长发育成植株。下列不属于Ⅰ细胞应具有的特征是

。A.薄壁细胞B.细胞质丰富C.液泡小D.细胞核小(4)若要判断转基因抗除草剂大豆是否成功，比较简便的检测方法是

。PCR

限制性核酸内切适宜浓度的甘露醇愈伤组织D用一定浓度的除草剂喷洒，观察转基因大豆的生长情况参考文献[1]彭邵锋,陆佳,陈永忠,等.木本植物原生质体培养体系研究进展[J].中国农学通报,2013,29(1):1-6.[2]王莉,姚占军.植物原生质体的制备与活力检测研究进展[J].生物技术通报,2009(s1):46-50.[3]梅兴国,潘学武,董妍玲.植物原生质体培养方法[J].生物学通报,2001,36(7):14-15.[4]徐文锦,刘湘,宁勇.植物原生质体融合技术的研究进展[J].中国农学通报,2008,32(1):46-48.[5]李文安.第八讲植物原生质体培养[J].植物生理学报,1979(3):52-59.[6]张颖.唐菖蒲原生质体分离、纯化及培养的研究[D].东北农业大学,2006.[7]李春艳,李妮亚,陈少良.植物原生质体培养与融合的研究进展[J].海南师范大学学报:自然科学版,2005,18(3):264-268.[8]LentzBR,LeeJK.Poly(e