高中生物拓展：土壤中分离以尿素为碳源的微生物 高二下学期

土壤中分离以尿素为氮源的微生物张萍华2021.071、学习从土壤中分离细菌的方法。2、练习无菌操作技能。3、掌握微生物大分子水解试验的原理与方法。实验目的尿素是一种重要的农业氮肥。但是，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。

脲酶氨导致培养基pH升高。酚红：pH6.8时为黄色；pH8.4时为粉红色实验原理CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）：Hp可产生高活性的尿素酶碳14、碳13呼气试验：碳13是稳定同位素，无任何放射性

碳14检测有微弱放射性菌落是指单个或少数细胞在固体培养基上大量生长繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构的子细胞群体。不同微生物形成的菌落具有不同的特征，是鉴定菌种的重要依据。

实验原理培养基：是指人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

用途：培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

组成：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水

实验原理种类：按照成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基按照物理性质：固体、液体、半固体按照用途：培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物

配方：

LB培养基：蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化钠1g,pH7.4-7.6，蒸馏水100mL（固体培养基加琼脂粉2g）尿素培养基：葡萄糖1g,氯化钠5g,磷酸氢二钾5g,酚红10mg琼脂糖20g,脲80g总体积1000mL

实验原理配制流程：

培养基的制备方法

称量熔化调pH分装加塞、包扎无菌检查搁置斜面灭菌（121℃、20'）

实验原理试管培养基的分装实验原理试管培养基的分装实验原理消毒与灭菌灭菌：是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。1、加热法：

干热灭菌：火焰烧灼、热空气湿热灭菌：高压灭菌、常压灭菌（煮沸消毒、巴氏消毒法、间歇消毒法）2、过滤除菌3、辐射灭菌4、化学药品灭菌（环氧乙烷）

实验原理高压蒸汽灭菌基本原理

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，高于100℃，致使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。是湿热灭菌中最好的方法，常用：1.05kg/cm2（温度121ºＣ），20－30min。

实验原理高压蒸汽灭菌步骤：1.加水；2.放置物品；3.加盖和加热；4.排净冷空气；5.灭菌：压力0.103MPa，温度121ºＣ，20－30min；6.关闭、降压0，打开；7.制成斜面。

1.土壤取样2.制备培养基3.倒平板4.样品稀释5.微生物培养与观察6.鉴定实验方法与步骤1.土壤取样取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”，含有大量微生物，而且种类最多。土壤要求：富含有机质、pH接近中性且潮湿。取样部位：距地表约3-8cm的土壤层。（可以增加液体培养基的增殖培养）实验方法与步骤尿素：20%，过滤除菌115℃，30分钟高压蒸汽灭菌实验方法与步骤2.制备培养基砂芯漏斗：漏斗的砂芯滤板由烧结玻璃料制成，可以过滤酸液和用酸类处理，也叫耐酸漏斗。根据其孔径大小，砂芯滤板可分成G1~G6六种规格。G1:20-30μm滤除粗沉淀及胶状沉淀物G2:10-15μm滤除粗沉淀及气体洗涤G3:4.5-9μm滤除细沉淀，过滤水银G4:3-4μm滤除细沉淀或极细沉淀物G5:1.5-2.5μm滤除体积较大的杆状细菌和酵母G6:＜1.5μm滤除1.5~0.6um的病菌0.22μm脲：控制在1%-4%（1）将LB培养基熔化后冷却到50

℃左右倒平板。（2）将尿素培养基熔化后冷却到50℃左右，加入过滤除菌后的尿素溶液，混匀，倒平板。a皿叠法b手持法实验方法与步骤3.倒平板实验方法与步骤4.土壤稀释液的制备1）每组取6支试管，每支试管先加4.5mL无菌水。2）称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。3）梯度稀释法制备土壤稀释液实验方法与步骤4.土壤稀释液的制备

用无菌吸管分别吸取相应稀释液各0.1mL，对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。尿素培养基：10-2、10-3LB培养基：10-6、10-7实验方法与步骤5.涂布与培养：培养：倒置于37℃培养箱中培养，LB培养基培养1天，尿素培养基培养4天。观察与计数：取出后观察，观察尿素培养基平板与LB培养基平板上的菌落数及颜色变化，选择菌落数在30~300之间，取平均值，进行计数。实验方法与步骤6.培养与观察10-2，培养3天10-3，培养3天10-4，培养3天10-2，培养4天10-3，培养4天10-4，培养4天实验方法与步骤6.培养与观察实验方法与步骤6.培养与观察

分别数出2个稀释度下的菌落数（单位：CFU）。

CFU：colonyformingunit

活菌