高考总复习生物（人教版）课件第十二单元生物技术实践第39讲微生物的培养与应用

生物技术实践第十二单元第39讲微生物的培养与应用1．微生物的分离和培养。2.培养基对微生物的选择作用。3.某种微生物数量的测定。4.微生物在其他方面的应用。栏目导航考点一培养基及微生物的纯化培养技术

考点二微生物的筛选和计数

1．培养基(1)概念：人们按照微生物对___________的不同需求，配制出供其___________的营养基质。(2)营养组成：一般都含有__________________和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对________、氧气以及_______________的要求。(3)种类：按照物理性质可分为________培养基和固体培养基。考点一培养基及微生物的纯化培养技术营养物质生长繁殖水、碳源、氮源pH特殊营养物质液体2．无菌技术(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止____________的方法。(2)关键：防止___________的入侵。(3)不同对象的无菌操作方法(连线)杂菌污染外来杂菌3．大肠杆菌的纯化培养(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基①操作步骤称量灭菌倒平板②倒平板的方法及注意事项a．请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：__________________。b．甲、乙、丙中的灭菌方法是____________。c．丁中的操作需要等待________________才能进行。丙→乙→甲→丁灼烧灭菌平板冷却凝固(2)纯化大肠杆菌的方法①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到________________________的肉眼可见的________，即可获得较纯的菌种。②纯化大肠杆菌的关键步骤：________。③常用的微生物接种方法有两种a．平板划线法：是通过____________在琼脂固体培养基表面___________的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。b．_______________法：是将菌液进行一系列的____________，然后将____________的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。由一个细胞繁殖而来菌落接种接种环连续划线稀释涂布平板梯度稀释不同稀释度(3)菌种的保存方法①对于频繁使用的菌种，可以采用____________的方法。②对于需要长期保存的菌种，可以采用___________的方法。临时保藏甘油管藏1．消毒和灭菌的比较项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属工具高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌2.纯化微生物的接种方法项目平板划线法稀释涂布平板法原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基上。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落优点可以观察菌落特征，对混合菌进行分离可以计数，可以观察菌落特征缺点不能计数操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用范围适用于好氧菌适用于厌氧菌和兼性厌氧菌走出微生物培养的4个误区(1)平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同①第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。②每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。③划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。(2)稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。而显微计数法由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能比实际值“偏高”。(3)平板划线法只适用于微生物的提纯，不适用于微生物的计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。(4)倒平板的温度一般在50℃左右适宜，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。平板冷却凝固后需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。1．(2016·全国卷Ⅲ)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用____________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是____________________________________________________。(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_________________和_____________________。分离纯化时应挑选出_____________的菌落作为候选菌。(3)乳酸菌在－20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的_________(填“蒸馏水”、“甘油”或“碳酸钙”)。无菌水泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落鉴别乳酸菌中和产生的乳酸(或酸)

具有透明圈甘油解析：(1)分离纯化乳酸菌时，由于泡菜滤液中菌的浓度高，因此需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，其目的是将聚集在一起的乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单菌落。(2)乳酸菌代谢过程中可产生乳酸，若在培养基中加入碳酸钙，则碳酸钙既可以中和乳酸，又可以在乳酸菌菌落的周围出现明显透明圈．据此可以用于乳酸菌的鉴别。(3)乳酸菌在－20℃长期保存时，为了避免水结冰产生冰晶损伤细胞，在菌液中常需要加入一定量的甘油。2．(2013·全国卷Ⅱ)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用________法或_________________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。(2)取该单菌落适当稀释，用________________________法接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。划线稀释涂布(或涂布)

涂布(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A___________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B_______________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明_____________________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的________________________。(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素__________。敏感不敏感该致病菌对C的敏感性比对A的弱耐药菌A解析：(1)将细菌接种到固体培养基上的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(2)由(1)获取的致病菌单菌落，经过适当稀释，用涂布法接种至固体培养基表面进一步培养。(3)在检测致病菌对抗生素的敏感性实验中，若含A种抗生素的滤纸片周围出现透明圈，说明周围的致病菌死亡，该致病菌对A种抗生素敏感；若含B种抗生素的滤纸片周围没有出现透明圈，说明致病菌对B种抗生素不敏感；若含C种抗生素的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；若含D种抗生素的滤纸片周围透明圈也比含A的小，说明A、B、C、D四种抗生素的杀菌效果最显著的为A。透明圈中出现的菌落为耐药菌。(4)根据(3)中分析，为达到抗菌目的最好选用抗生素A。3．环境有毒物质多聚联苯难以降解，科研人员从自然界中筛选获得了只能降解利用多聚联苯的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：(1)②中培养目的菌株应在_______________(填“选择培养基”或“鉴别培养基”)中加入______________作为碳源。如果要测定②中活细菌数量，常采用___________________法。(2)④的作用为____________，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于_________________________________________________________________________；使用稀释涂布平板法或平板划线法可以在⑥上获得________。采用固体平板培养细菌时进行________(填“倒置”或“正放”)培养是为了____________________________________________________。(3)如何比较不同菌株降解多聚联苯能力的大小？________________________________________________________________________________________________。选择培养基多聚联苯稀释涂布平板对照④的培养基没有加入多聚联苯作为碳源，⑤培养基中加入多聚联苯作为碳源单菌落倒置防止皿盖上形成的水珠滴落在培养基上污染培养基用多聚联苯浓度相同的培养液分别培养浓度相同的不同菌株，一定时间后，测定培养液中多聚联苯的含量解析：(1)为筛选出只能利用多聚联苯的细菌菌落，应在②(选择培养基)中加入多聚联苯作为碳源。常采用稀释涂布平板法进行细菌的计数。(2)微生物在④中不生长，在⑤中生长，说明④的作用为对照，④的培养基没有加入多聚联苯作为碳源，⑤培养基中加入多聚联苯作为碳源。用稀释涂布平板法或平板划线法可以筛选出单菌落。细菌培养时平板倒置的原因是防止皿盖上形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。(3)设计检测不同菌株降解多聚联苯能力大小的实验时，要特别注意单一变量原则和对照原则，即应该用多聚联苯浓度相同的培养液分别培养浓度相同的不同菌株，一定时间后，测定培养液中多聚联苯的含量。1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数考点二微生物的筛选和计数项目详细内容实验原理(1)能合成________的细菌才能分解尿素(2)配制以________为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌数量统计(1)______________法(显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板)(2)间接计数法：__________________实验流程土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→___________→涂布平板与培养→菌落________脲酶尿素直接计数稀释涂布平板法系列稀释计数复合酶C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶纤维二糖葡萄糖(2)纤维素分解菌的筛选①原理纤维素分解菌↓红色复合物透明圈②筛选方法：__________染色法，即通过是否产生__________来筛选纤维素分解菌。③培养基：以__________为唯一碳源的选择培养基。刚果红透明圈纤维素④实验流程土壤取样：富含________的环境

↓选择培养：用________________培养，以增加纤维素分解菌的浓度

↓____________：制备系列稀释液

↓涂布平板：将样品涂布到___________________的培养基上

↓挑选产生________的菌落纤维素选择培养基梯度稀释鉴别纤维素分解菌透明圈(3)分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较分离纤维素分解菌的实验中先用________培养基，再用________培养基。①选择培养基为________培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。②鉴别培养基含琼脂，为________培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是鉴别培养基。选择鉴别液体固体1．筛选分解尿素的细菌与分解纤维素的微生物的比较2．选择培养基与鉴别培养基的比较种类制备方法原理用途举例选择培养基培养基中加入某些化学物质依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计从众多微生物中分离所需的微生物加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌鉴别培养基培养基中加入某种指示剂或化学药品依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计鉴别不同种类的微生物伊红－美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌3.统计菌体数目的方法(1)显微镜直接计数法①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。②方法：用计数板计数。③缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。1．(2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生__________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是___________________________________________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是____________________________________________________________(答出两点即可)。脲酶分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________________________________________________________________________________________。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_________________________________________________________________(答出两点即可)。尿素其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定解析：(1)能分解尿素的细菌体内应含有脲酶；能分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物，可用葡萄糖等有机物作为碳源。进入细菌体内的葡萄糖既能为细胞生命活动提供能量，又可为其他有机物的合成提供原料。(2)筛选可分解尿素的细菌，应选择以尿素为唯一氮源的培养基，而能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，其他两组不能起到筛选作用。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，这两种物质既可为细菌生长提供无机营养，又可作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH相对稳定。2．(2014·全国卷Ⅰ)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将_______________分解成_______________。(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________________________。纤维二糖葡萄糖红透明圈(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水培养基甲＋＋＋＋－＋＋培养基乙＋＋＋－＋＋＋注：“＋”表示有，“－”表示无。据表判断，培养基甲_________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________________________________________________________________________。不能液体培养基不能用于分离单菌落不能培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌解析：(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。用含有刚果红的纤维素培养基培养纤维素分解菌时，由于纤维素被分解，红色复合物无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。(3)培养基甲未使用琼脂，为液体培养基，不能用于分离单菌落。含有纤维素和刚果红(CR)的培养基可分离和鉴别纤维素分解菌。3．(2018·河南六市联考)微生物强化采油(MEOR)是利用某些微生物能降解石油，增大石油的乳化度，降低石油黏度的原理，通过向油井中注入含微生物的水来提高采油率的新技术。以下是人们筛选、纯化和扩大培养该类微生物的实验操作。请回答下列问题：(15分)(1)土壤是微生物的大本营，该类微生物应取自___________________________的土壤。(2)为筛选和纯化该类微生物，从功能上分，应选用__________培养基。常用的接种方法是_______________和__________________________。长期被石油污染(含石油多的)选择平板划线法稀释涂布平板法(3)接种后，应密封培养的原因是___________________________，培养一段时间后在培养基上形成降油圈，此时选取________________________就可获得高效菌株。(4)扩大培养过程中需要对微生物进行计数。取0.2mL样品，用固体培养基对其培养，最后统计三个平板，菌落数分别是200、180、220。则样品中微生物的数量为_________个/mL。该统计结果_________(填“低于”“高于”)实际值。该类微生物是厌氧型的降油圈大的菌落1000

低于解析：(1)在长期被石油污染的土壤中生存下来的微生物，能降解石油，所以取样时，应从含石油多的土壤中采集。(2)从功能上分，应选用特定的选择培养基进行筛选和纯化该类微生物；常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(3)该类微生物是厌氧微生物，接种后应密封培养；培养一段时间后在培养基上可形成降油圈，降油圈越大．说明该处的微生物降解石油的能力越强，所以应选择降油圈大的菌落进行培养以获得高效菌株。(4)计算微生物的数量应取三个平板的平均值．即(200＋180＋220)÷0.2＝1000(个/mL)，该结果会低于实际值，因为当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落数。[网络构建·答题必备]

1.无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒和紫外线消毒等；灭菌包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。2．培养基的制备包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。3．大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求菌液要充分地稀释。4．微生物的计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。5．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。

1．(2016·全国卷Ⅰ，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；②制作无菌平板；③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。[探究高考·模拟演练]回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于__________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是___________。(2)步骤③中，实验组的操作是__________________________________________________________________________。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_________________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法______________(填“正确”或“不正确”)。牛肉膏、蛋白胨琼脂将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间污染不正确解析：(1)培养基中的牛肉膏和蛋白胨可为培养基中的微生物提供氮源；制备固体培养基需加入琼脂。(2)该实验的目的是了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况，所以需在教室不同高度的位置分别用平板收集微生物即开盖暴露一段时间。(3)该实验中空白对照组不应出现菌落，若空白对照组出现了菌落，则说明此次调查中出现了污染现象，实验组的污染情况不能确定，故不能用实验组与空白对照组菌落数的差值作为实验结果，而应重新进行实验。2．(2014·全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________________；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_______________。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过___________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是__________________________________________。检测培养基平板灭菌是否合格3.8×107

灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(3)示意图A和B中，___________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中_____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高______________的利用率。B

溶解氧营养物质解析：(1)取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，可依据是否产生菌落确定培养基的灭菌效果是否理想。由样品中菌株数计算公式：(C÷V)×M知：1mL水样中菌株数为(38÷0.1)