分子生物学反应

分子生物学反应

主要内容:

1）SDS的工作原理

蛋白酶和蛋白酶抑制剂的工作原理

（3）琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的

042乙醇是如何沉淀DNA和RNA的

5）碱裂解的工作原理

主要内容列表

一、SDS的工作原理

SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是实验室常

用的基于蛋白质分子量对蛋白质进行分离的方法。

SDS根据蛋白质的分子量来分离蛋白质，基于施加电场的

作用下通过筛分基质（凝胶）产生的迁移率。

1.使蛋白质的迁移率与分子量成正比

任何带电物种在电场中的运动都是由其净电荷、分子半径和外加

电场的大小决定的。但自体折叠的蛋白质所带来的问题是，它们的净电

荷和分子半径都不依赖于分子量。相反，它们的净电荷由氨基酸组成决

定，即蛋白质中的氨基酸正、负电荷之和以及蛋白质三级结构的分子半

径决定。

因此，在它们的原生状态下，具有相同分子量的不同蛋白质在电

场中以不同的速度迁移，这取决于它们的电荷和三维形状。

为了根据分子量在电场中分离蛋白质，我们需要将蛋白质还原为

线性分子，破坏三级结构，并以某种方式掩盖蛋白质的固有净电荷。这

就是SDS的应用来源。

2.SDS的作用

SDS是一种存在于SDS缓冲液中的洗涤剂,在这种缓冲液

中，伴随着一点煮沸和还原剂（通常是DTT或3ME来分解蛋白质-蛋

白质二硫键），它会破坏蛋白质的三级结构。这将折叠的蛋白质转变为

线性分子。

SDS破坏蛋白质三级结构

SDS利用均匀的负电荷覆盖蛋白质，从而掩盖R-基团的固有电荷。

SDS与线性蛋白（约1.4gSDS/lg蛋白）的结合相当均匀，这意味着

蛋白质的电荷现在与它的分子量近似成正比。

SDS也存在于凝胶中以确保一旦蛋白质被线性化甩荷被掩盖，

但蛋白质在整个电泳分离过程中仍保持这种方式（与分子量成正比的迁

移）。

SDS包被的蛋白在凝胶中的迁移率的主要决定性因素是它的分子

半径。

SDS包被的蛋白已被证明是线性分子，18A宽，长度与分子量成

正比,因此分子半倒它们在凝胶中的迁移率）由蛋白质的分子量决定。

由于SDS包被的蛋白质具有相同的电荷质量比，因此不存在基于电荷

的差异迁移。

3.凝胶基质

在外加电场中，SDS处理后的蛋白质现在将以不同分子量产生的

不同速率向阴极移动。这些不同的迁移率将被凝胶基质的高摩擦环境扩

大。

SDS的凝胶基质是聚丙烯酰胺，它具有化学惰性，并且至

关重要的是可以很容易地在各种浓度下制备不同的孔径，可以产生不同

的分离特性。

4.不连续缓冲体系与浓缩凝胶

为了通过凝胶将电流从阳极传递到阴极，需要缓冲液。我们通常

使用不连续Laemmli缓冲系统。"不连续”仅仅意味着凝胶和电泳槽

的缓冲液是不同的。

通常该系统采用PH6.8的Tris-HCI缓冲液配置的浓缩胶,pH8.8

的Tris-HCI缓冲液配置的分离胶以及pH8.3的电极缓冲液，浓缩胶具

有低浓度的丙烯酰胺，分离胶具有更高的浓度，能够延缓蛋白质的运动。

Tris-GlypH8.3-

Tris-HCIpH6.8

Tris-HCIpH8.8

Tris-GlypH83

非连续缓冲系统

那些不同的pH是怎么回事儿？甘氨酸可以以三种不同的电荷状态存在,

正电荷、中性电荷或负电荷，这取决于pH值。用不同的缓冲液控制甘

氨酸的电荷状态是整个浓缩胶的关键。

缓冲液pH对谷氨酸电荷的影响

同时，这也是浓缩胶的工作原理，当电源接通时，在pH8.3电

极缓冲液中带负电荷的甘氨酸离子被迫进入浓缩胶（pH为6.8）,在

这种环境中，甘氨酸主要转变为两性离子（中性电荷）状态。电荷的这

种损失使它们在电场中移动得非常缓慢。

另一方面，氯离子（来源于Tris-HCI）在电场中移动得很快，它

们形成一个离子锋，在甘氨酸之前迁移。从Tris平衡离子（正朝阴极移

动）中分离出的CI-形成一个具有陡峭电压梯度的狭窄区，该电压梯度

将甘氨酸往后拉，导致迁移离子产生两个狭长迁移前沿，高流动性的

CI-前沿，然后是较慢的中性甘氨酸前沿。

所有凝胶中的蛋白质样本的电泳迁移率处在甘氨酸和CI-迁移率

的极值之间。因此当两个前沿进入样品孔时，蛋白质浓缩到CI-和甘氨

酸之间的狭窄区。

5.当蛋白质离开浓缩胶

浓缩胶迁移过程结束后，进入分离胶，pH转变为8.8,在该pH

下，甘氨酸分子大多带负电，迁移速度比蛋白质快得多。因此，甘氨酸

加速通过蛋白质，而蛋白质留在分离胶中。

结果是，蛋白质在浓缩和分离胶的界面处被浓缩到非常窄的带中，

并且由于分离胶中丙烯酰胺浓度的增加，这减缓了蛋白质根据其分子量

大小的运动，分离开始。

6.浓缩胶起到了什么作用

浓缩胶胶孔约1cm深，通常需要填充足够的蛋白在凝胶上。因此,

缺少浓缩胶的情况下，样本则置于分离胶上，而样本条带将达到1cm

深。

与浓缩成一条带同时进入分离胶相比，没有浓缩胶意味着蛋白质

在不同时间分别进入浓缩胶而形成弥散条带。

因此，浓缩胶确保蛋白质同时达到分离胶，分子量相同的蛋白质

则形成紧密条带进行迁移。

7.蛋白质分离

一旦蛋白质进入分离胶，则因高分子量蛋白质通过多孔丙烯酰胺

凝胶的速度比低分子量蛋白慢而被分离。凝胶孔的大小可以根据丙烯酰

胺浓度和蛋白质分子量大小而改变。

对于更宽的分离范围，或对于难以分离的蛋白质，可以使用具有

丙烯酰胺浓度增加的梯度凝胶。

二、蛋白酶和蛋白酶抑制剂工作原理

1.蛋白酶：好的，坏的，水解的

所有生物体都有蛋白水解酶和磷酸化酶，包括：你、我、甚至棉铃虫。

虽然蛋白酶涉及到从宿主防御到伤口愈合乃至病毒复制的各个方面,但

根据蛋白酶活性位点的构胡口与目标肽键的相互作用，可以大致分为两

大类。

1）通过丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸在其活性部位的亲核活化水解键；

2）天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶，利用水本身进行水解。

2.抑制剂:你不能只靠一种

化学分解、碰撞摩擦、超声波和冻融，把整个系统都弄得乱七八

糟。没有肽键是安全的！

外肽酶攻击氨基酸链的末端，而内肽酶水解它们的内部连接。激

酶磷酸依口去磷酸化随意。

没有一种抑制剂能清除所有蛋白酶，阻止每一个磷酸化事件。它

需要一种“鸡尾酒”的方法来阻止蛋白质分解。蛋白酶抑制剂在胁迫下

可以不可逆、可逆和可逆地作用，可以是任何小分子，如氟化钠，也可

以是进化过程中自身微生物抑制剂多肽类似物。它们可以与底物竞争活

性位点，有时会破坏或者囤积蛋白酶功能所需的珍贵阳离子。

竞争性抑制剂的作用是以类似底物的方式与活性位点结合通过修

饰阻止蛋白酶，例如，酯化反应。许多大的竞争抑制剂通过增强亲和性

和特异性结合。

竞争性的阻碍因素。因素种类繁多，从抑肽酶，一种6kDa的多

肽丝氨酸蛋白酶(在极端的pH值是可逆的)，到正钢酸钠，一种抑制

易受骗蛋白-酪氨酸磷酸酶的小分子。

螯合剂利用它们对金属离子的增强亲和力与金属离子螯合，而不

能与其他成员发生反应。金属蛋白酶的活性部位需要锌、镁、镒、钙,

甚至钻来活化水，水解肽键，以达到水解目的。把锌和乙二胺四乙酸

(EDTA)结合起来，把钙和乙二胺四乙酸(EGTA)结合起来，金属蛋

白酶就不再有活性了。

三、琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的

1.琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的

聚丙烯酰胺主要用于SDS,是由丙烯酰胺单体和双丙烯酰

胺单体组成的基质。它的优点是化学惰性，因此在蛋白质通过时不会与

蛋白质发生相互作用，而且它可以用不同的孔径轻松地、重复地制造出

具有不同分离特性的凝胶。

聚合反应，是自由基催化的乙烯基加成反应。该反应由TEMED

引发，引发过硫酸锭(APS)自由基的生成。自由基将电子转移到丙烯

酰胺/双丙烯酰胺单体上，使它们呈放射状并相互作用形成聚丙烯酰胺

链。

Potyacryidrr^de

Bii-acrylamide

OU-CH

I

coAcrylamide

jCH2=CH

NHl

QU+c-o

INH;S04•

NH

I

C-0

I

CHACH

NH4s2O8

(APS)

聚丙烯酰胺聚合反应

在缺失双丙烯酰胺的情况下，丙烯酰胺会聚合成长链，而不是多

孔凝胶。双丙烯酰胺交联丙烯酰胺链，是形成多孔凝胶基质的原因。通

过改变丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例，可以控制交联的量，决定凝胶的

孔径和分离特性。

2.琼脂糖凝胶形成

琼脂糖一凝胶琼脂的主要成分，可以从某些海藻中分离出来一本

身就是一种聚合物。但是，聚合不是琼脂糖凝胶形成的机制。

在化学上，琼脂糖是一种多糖，其单体单元是D-半乳糖和3,6-

脱水-L-半乳毗喃糖的二糖。

琼脂糖的结构

在低于35（的水溶液中，这些聚合物链通过非共价键相互作用

（像氢键）和静电相互作用被保持在多孔凝胶结构中。

加热溶液会破坏这些非共价相互作用，并使链脱离。

当溶液冷却时，这些非共价相互作用被重新建立并且形成凝胶。

所以，琼脂糖（和琼脂）凝胶是通过氢键和静电相互作用而不是

通过聚合形成的。

四、乙醇是如何沉淀DNA和RNA的

乙醇沉淀法是一种在水溶液中浓缩和脱盐核酸（DNA或RNA）的常用

方法。最基本的步骤是在水溶液中加入盐和乙醇，迫使核酸从溶液中沉

淀出来。

通过离心分离沉淀的核酸。核酸颗粒在70%的冷乙醇中洗涤，进一步

离心后，干燥去除乙醇，核酸颗粒被重新悬浮在干净的缓冲液中。

1.关于溶解度

首先我们需要知道为什么核酸能溶于水。水是一个极性分子，由

于非共享的电子对，它在氧原子附近有部分负电荷，在氢原子附近有部

分正电荷。

由于这些电荷，极性分子，如DNA或RNA,可以与水分子静电

作用，使它们很容易溶于水。

因此，极性分子可以被描述为亲水性分子，而非极性分子是疏水

性的，它们不易与水分子相互作用。

核酸是亲水性的，这是由于糖磷酸主链上带负电荷的磷酸（PO3-）

基团。

水分子的极性

2.盐的作用

盐在实验中的作用是中和糖磷酸骨架上的电荷。一种常用的盐是

醋酸钠（乙酸钠），在溶液中，乙酸钠分解成NA+和[CH3co0]-。

带正电的钠离子中和了核酸上PO3-基团的负电荷，使分子的亲

水性大大降低，因此在水中的溶解度大大降低。

3.乙醇的作用

溶液中Na+离子与P03-离子之间的静电吸引受库仑定律的支配,

受溶液介电常数的影响。

水具有很高的介电常数，这使得Na+和P03-很难结合在一起。

另一方面，乙醇具有较低的介电常数，使得Na+更容易与P03-

相互作用，屏蔽其电荷，使核酸不太亲水，导致其从溶液中脱落。

4.温度的作用

低温（如-20或-8（TC）下保存核酸/盐/乙醇混合物用于沉淀核酸

通常在实验中认为是必要的。

然而，这不是必需的，因为浓度低至20ng/mL的核酸在0-4C

时会沉淀，因此在冰上孵育15-30分钟就足够了。

5.70%无水乙醇洗涤步骤

把沉淀的DNA颗粒中的残留盐洗掉。

6.关于核酸沉淀的一些建议:

a.盐的选择

使用醋酸钠（0.3M终浓度，pH值5.2）进行常规DNA沉淀;

对于含有SDS的DNA样品，使用氯化钠（终浓度为0.2M）,

因为NaCI使SDS在70%乙醇中保持可溶性，因此不会与DNA一起

沉淀；

对于RNA，使用氯化锂（0.8M终浓度）。这是因为2.5-3体积

的乙醇应用于RNA沉淀，而LiCI比NaAC更易溶于乙醇，因此不会沉

淀，但要注意氯离子会抑制蛋白质合成和DNA聚合酶，因此LiCI不适

合用于体外翻译或反转录RNA的制备。在这种情况下，使用NaACo

使用乙酸锭（2M终浓度）去除dNTPs，但不用于制备应用于T4

多核甘酸激酶反应的DNA,因为钱离子抑制酶活性。

提高低浓度或小核酸片段沉淀的产率（＜100个核昔酸）

a.将MgCI2添加至最终浓度0.01M;

b.将离心前在冰上孵育的时间增加到1小时。

（下篇）

一、硅基质离心柱制备DNA和RNA的工作原理

1.裂解

裂解方法可能会根据需要DNA或RNA而有所不同，但其共同点是含

有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

杂化使氢键不稳定，范德华力和疏水相互作用。蛋白质不稳定，包括核

酸酶，核酸与水的结合被破坏，为核酸与硅机制结合创造条件。

离液盐包括盐酸胭、异硫氨酸服、尿素和高氯酸锂。

除了离液盐，裂解缓冲液通常还含有洗涤剂，有助于蛋白质的溶解和裂

解。

根据样品类型，也可以使用酶进行裂解。蛋白酶k就是其中之一，实际

上蛋白酶k在裂解缓冲液中起着非常好的作用；蛋白酶k的作用就越好,

蛋白质变性越完全。然而，溶菌酶在裂解缓冲液的变性条件下不起作用，

因此，通常在加入变性盐之前进行溶菌酶处理。

对于质粒的制备,裂解方式与提取RNA或基因组DNA有很大不同，

因为必须先从基因组DNA中分离出质粒。

如果加入离液盐，将立即释放胞内物质，并且无法从高分子量染色体中

区分出小的环状质粒。

因此，在质粒制备中，直到裂解后，才加入离液盐，并用于结合硅基质。

2.结合硅基质（Binding）

离液盐对裂解和硅基质的结合至关重要。

为了增强核酸与硅基质的结合，在结合阶段还加入了乙醇。通常是乙醇,

但有时可能是异丙醇。

乙醇的浓度和体积对结合有很大影响，浓度或体积太多会带来大量降解

的核酸和小片段，进而影响UV260的读数，使核酸浓度降低。浓度或

体积太少，可能很难洗掉膜上的残留盐。

重要的一点是，乙醇会影响结合，并且添加的量对于任何试剂盒都是优

化的。修改该步骤有助于获得核酸提取的效果，因此如果遇到问题并希

望排除原因，则可以进一步评估该步骤。

另一种问题的诊断方法，保留离心后过柱滤液，并进行沉淀操作，看是

否有核酸。如果在裂解过程中使用SDS的表面活性剂，试着用NaCI

作为沉淀剂，以避免污染DNA或RNA。

3.洗涤步骤

裂解液通过硅胶膜离心，现在DNA或RNA与柱结合，杂质，蛋白质

和多糖则通过。

但是，膜仍然会被残留的蛋白质和盐弄脏。如果样本来自植物，膜上仍

会残留多糖，可能还有一些色素，或者如果样本是血液，膜可能呈棕色

或黄色。

清洗步骤有助于去除这些杂质。通常有两种清洗方式，但因样本类型而

异。第一次洗涤通常会用少量的离液盐来去除蛋白质和有色污染物。然

后用乙醇清洗以除去盐。如果样本本身没有太多蛋白质，如质粒准备或

PCR产物纯化，那么只需要乙醇清洗即可。

4.离心柱的干燥

乙醇洗涤后，大多数操作步骤都有离心来干燥离心柱。这是为了去除乙

醇，是清洁洗脱的必要步骤。当10mMTris缓冲液或水填充到膜上进

行洗脱时，核酸会水合并从膜上释放。如果柱上还有乙醇，那么核酸就

不能完全再水化。

跳过干燥步骤会导致乙醇污染和核酸产量降低。

这个问题的主要迹象是当试图把样品加载到琼脂糖凝胶上时，即使在存

在染料的情况下，DNA不会下沉，而是漂浮在缓冲液中。乙醇污染的

另一个迹象是，如果你把样品放在-20摄氏度，它不会结冰。

5.洗脱

最后一步是从硅基质中释放出纯DNA或RNA。对于DNA的处理，通

常使用pH值在8-9之间的10mMTrisoDNA在稍微碱性的pH下更

稳定，在缓冲液中溶解更快。即使是DNA颗粒也是如此。水往往趋向

于低pH值，低至4-5,在短时间内洗脱时，高分子量DNA可能不完

全水化。通过让缓冲液在离心前在膜中停留几分钟，可以最大限度地洗

脱DNA。

另一方面，RNA在弱酸性pH值下稳定，因此水是首选洗脱液。RNA

很容易溶于水。

6.离心柱操作时容易出问题的事儿

核酸回收率低：因素有很多，通常是裂解问题，或者是过柱结合时条件

出现了问题。

确保使用新鲜的优质乙醺100%解释缓冲液或添加到过柱结合步骤。

质量差的乙醇或者长期储存的乙醇可能吸水，导致乙醇浓度发生变化,

如果洗脱缓冲液的配置出现问题，DNA或RNA就会被清洗时流失。

低纯度：如果样品被蛋白质污染（低260/280）,那么可能是因为样品

太多，蛋白质没有完全去除或溶解。如果样品的260/230比率很低，

则问题通常是来自结合缓冲液或洗涤缓冲液中的盐。确保使用最高质量

的乙醇来制备洗涤缓冲液，如果问题仍然存在，则提取是增加洗涤次数。

与其他样品相比，一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现

纯度问题，因为在提取过程中腐殖物质会被溶解。腐殖质类似于DNA,

很难从硅胶柱中除去。对于这种类型的样品，在过柱步骤之前需要使用

去除蛋白质和腐殖质的专门技术。

降解：主要是RNA，降解是由于样品储存不当或者裂解效率过低造成

的，不过前提是用不含RNase的水洗脱，对于DNA预处理来说，降

解并不是一个大问题，因为对于PCR来说，DNA有降解，扩增依旧可

以良好进行。但如果不希望DNA剪切过于严重，那么不要使用太强的

裂解方法。PCR纯化注意事项：PCR纯化是所有硅基质离心柱技术中

最简单的，因为它只需要添加高浓度的结合盐(通常在每个PCR反应

体系中添加3-5倍体积)并离心、柱体。因此，当PCR纯化试剂盒操作

失败时，可能会特别令人沮丧。所以纯化前，最好在凝胶上检测一下扩

增结果。

PCR反应体系中太多物质可在UV260处有吸收峰：核甘酸、洗涤剂、

盐和引物。PCR纯化试剂盒操作失败多数是因为没有获得扩增产物。

如果确定反应体系中，有PCR产物且浓度不低，可以保留过柱后的液

体，如果DNA没有发生结合，还可以进行挽救，重新进行纯化。

二、DNA连接酶工作原理

DNA连接酶(EC6.5.1.1)以共价方式将DNA的磷酸骨架与平末端或

配对的粘性末端连接起来，其作用是修复DNA分子中断裂的双链。

Cohesiveends

5ATCTAGAGGATCCTACGTATCG3

TAGATCTCCTAGGATGCATAGC5

Bluntends

5ATCTACCCOGGCGTATCG—

TAGATGGGCCCGCATAGC5'

粘性末端与平末端示意图

在分子生物学中，它通常用于将限制性内切酶产生的DNA片段插入载

体。商业连接酶提供含有ATP和Mg2+的反应缓冲液，这两种物质对

连接酶活性都是必不可少的。

由于反复的冻融可能会破坏ATP,所以最好将溶液进行分装。

链接反应本身有两个基本步骤。首先，DNA末端必须偶然碰撞，并保

持在一起足够长的时间，以便连接酶连接它们。

低温反应更容易。所有的分子在更高的温度下移动得更快，如果它们在

低温下轻轻地漂浮在溶液中，而不是像在更高的温度下那样呼啸而过,

那么两个DNA末端碰撞并保持在一起会更容易。对于粘性末端，较低

的温度稳定了互补核苜酸之间的氢键，有助于保持性对位置。

第二步是酶促反应：DNA连接酶通过两步催化3--0H与5'-磷酸基团

连接。首先，与酶活性部位的赖氨酸残基相连的AMP核甘酸被转移到

5'-磷酸。然后磷酸腺苜键被3'-0H攻击，形成共价键并释放腺甘酸。

为了让酶进行进一步的反应，酶活性部位的AMP必须由ATP补充。

DNA连接酶在25（时具有最佳活性，因此连接反应在使DNA末端连

接在一起的最佳温度（1℃）和酶反应（25（）之间的权衡温度下进行。

通常在EC下1小时是可以的，但是由于将DNA末端连接在一起是

反应中最不有效的部分，因此通过将温度降低到4＜来促进这一点可以

提供更高的效率。然而，酶在这个温度下工作非常缓慢，因此需要很

长的（如过夜）反应时间。

CCT►CCT

-GG-A-G---O-A

AMP

0CT4____cCT

-GG-A-G--

连接酶作用原理示意图

三、比色分析的工作原理

1.对硝基苯基磷酸酯一分析机制

对硝基苯磷酸酯（pNPP）作为一种合成底物广泛应用于各种磷酸酶的

催化活性测定。pNPP的磷酸基团被酶裂解生成对硝基苯酚，由于对硝

基苯酚在水中电子激发的最大波长为318nm,因此对硝基苯酚也是无

色的。然而，在碱性条件下，对硝基苯酚转化为对硝基苯酚阴离子，导

致向400nm左右的深色偏移（根据溶液条件将化合物的吸收峰改变为

较长波长）。这是电磁光谱的蓝色边缘，但是由于我们看到反射光的颜

色（与吸收光相反），溶液看起来是黄色的。

要记住的事情：

铭酸盐转移是分析的关键因素。

举例来说，如果酶的活性要求在酸性范围内有一个最佳的pH值，那么

酸性磷酸酶的情况正好如此。

在这种情况下，为了获得所需的黄色，必须在终点添加强碱（例如氢氧

化钠或氢氧化钾）。

2.孔雀绿一分析机制

对硝基苯磷酸测定是很好的,但是如果你最喜欢的磷酸酶不能有效地代

谢pNPP呢？另一种市面上可买到的磷酸酶测定法是孔雀绿测定法。这

种简单的测定方法是基于孔雀绿、铝酸核和游离正磷酸盐（又称无机磷

酸盐，pi）在酸性条件下形成的络合物。

正磷酸盐被磷酸酶分解后从磷酸化底物中释放出来，在硫酸溶液中与铝

酸铁形成络合物。孔雀绿磷铝酸盐络合物的形成,在620-650nm处测

量，与游离正磷酸盐浓度直接相关。因此，有可能量化蛋白质磷酸酶底

物的磷酸化和磷酸释放。

要记住的事情：

这种方法仅测量无机游离磷酸盐;在测量之前，必须首先水解和中和有

机磷酸盐(脂质结合或蛋白质结合磷酸盐)。了解不同种类的有机磷酸

盐及其各自不同的水解自由能有助于优化分析条件。高能有机磷酸酯

(缩醛磷酸酯、酸酊等)具有不耐酸的磷酸基团，可在低pH下孵育释

放到溶液中。另一方面，低能有机磷酸盐(磷酸酯)在酸性溶液中稳定，

需要更苛刻的条件(如热分解)才能用这种方法检测。

在大量孔雀绿存在下，3:1离子缔合物［(MG+)3(PMol2O403-)］容易

在酸性水溶液中形成和沉淀。为了稳定水溶液中的1：1离子缔合物，在

溶液中加入聚乙烯醇。

Enzyme*Substrate・.(ES)>Enzyme♦P,

P,♦(NHAMoO.K.H)PMOUO40

2e

H)PMOi204o♦HMG*W.(MG)(H2PMou04o)♦2H.

(yellow)(matocMegreen)(gre«a「乏》1叼)

(yHowf「446nm)

分析机制示意图

在分析过程中要考虑的另T牛事是任何可能干扰分析的氧化还原反应

的可能性。祖是一种过渡金属，因此存在于多种氧化状态。在铝酸盐阴

离子中，它具有+6的氧化状态。通过有机化合物，如抗坏血酸和还原

糖(即葡萄糖)或无机化合物(如