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曹宁:PCR及其衍生技术在病原微生物检测中的应用研究安徽工程大学PAGE2PAGE1PCR及其衍生技术在病原微生物检测中的应用研究摘要:,随着现代生物技术的快速发展,建立在分子生物学基础上的快速检测病原微生物技术得到了迅速的发展。由于PCR技术具有敏感、专一等特点,不仅可以对病原微生物进行特异性识别,而且可以鉴别同一种类病原微生物的致病性菌株和非致病性菌株,因此应用PCR技术进行病原微生物的检测具有十分独特的优势。文章介绍了PCR及其衍生技术RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫-PCR、多重PCR、套式引物PCR、巢式PCR及在病原微生物检测中的应用。关键词:PCR、病原微生物、检测、应用1、PCR检测技术的原理聚合酶链式反应( PolymeraseChainReaction,PCR),又称为无细胞克隆技术(FreeBacteriaCloningTechnique),是一种根据生物体内DNA复制的某些特点而设计的,在体外对特定DNA序列进行快速扩增的技术。自美国Cetus公司人类遗传室KaryMullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(PCR)以来,PCR技术及其相关技术就以惊人的速度发展起来,在多种核酸检测技术中都得到了广泛的运用。PCR反应体系主要由寡核昔酸(引物)、4种dNTP、TaqDNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成,它改变了传统分子克隆技术的模式,不通过活细胞,而是将扩增建立在三步重复发生反应的基础上:①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA;②退火延伸引物至特异性寡核昔酸上;③酶促延仲引物与DNA配对合成模板,引物退火,变性DNA片段,引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核昔酸通过聚合酶的作用形成互补的DNA片段,并能重新裂解成单股DNA,成为下次PCR复制的模板。因而每次循环特异性DNA片断将以双倍量增加,典型扩增经过20~4次循环能引起100万倍的扩增,大大提高了DNA的得率。因此,当知道待检病原具有某一特定基因片段时,即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR扩增,增加靶DNA数量,使其达到足够的检测量,通过电泳检测扩增出的特定片断,即可确定感染的病原。2、PCR及其衍生技术在病原微生物检测中的应用2.1、普通PCR的应用普通PCR的原理就是根据病毒或其他病原体的已知保守核昔酸序列设计出引物,对待测核酸的特异性片段进行扩增,之后对扩增产物进行电泳分析,通过是否能扩增出特异性条带来判断样品中是否有病原DNA。由于普通PCR技术具有高度的敏感性,同时又能直接扩增无需增菌的样品,因此,在病原微生物快速检测,尤其是突发公共卫生事件快速检测方面大有用武之地。彭宣宪[1]等采用细菌的16srRNA基因保守区特异引物,以嗜水气单胞菌、鲁克氏耶尔森菌(Yersiniaruckeri)和鳗弧菌等6种常见病原菌为对象,建立了PcR一SScP技术,能完成对多个病原的同时检测,特异性好且快捷、经济。李业鹏[2]等选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,对经过传统方法鉴定过的22种77株沙门菌和24株非沙门菌进行非特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件研究,采用普通PCR技术在19h内可检出含有沙门菌102CFU/g的食品,与传统方法相比既缩短了检测时间,又可对大量样品同时进行检测。2.2、RT-PCR的应用反转录PCR(Reversetranseription-polymerasechainreaction,RT-PCR),其原理就是用反转录酶将RNA转录为cDNA后用PCR对cDNA进行扩增。较PCR而言,RT-PCR显示出了更高的灵敏性。Lin[3]对从马拉巴石斑鱼(E‘malabaricus)和紫石斑鱼(E.laneeolatus)分离的NNV编码衣壳蛋白的RNA2基因进行了克隆和测序。江育林[4]等也用RT-PCR法快速检测出了桃拉病毒。包红梅[5]等通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732bp。用该方法检测H1~H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIVH9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。2.3实时荧光定量PCR的应用实时定量PCR(Real-timeQuantitativepolymerasechainreactionn)与以前的以终点法进行定量的PCR技术相比具有无与伦比的优势。首先,它不仅操作简便、快速高效,高通量,而且具有很高的敏感性、重复性和特异性。其次,由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,大大降低了污染的可能性,并且无须在扩增后进行操作。实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术应用于常规PCR仪中,指在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料,利用荧光信号积累,从而实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析的方法[6]。采用荧光定量PCR技术检测环境中的微生物病原体,无需培养而是直接取样进行分析。特异性强、灵敏度高、迅速简便且具有较高的精确度。Brooks[7]等对雨季时海水中的甲肝病毒,采用该技术进行了检测及定量分析。研究证明,该技术对甲肝病毒的定性及定量测定均有很高的精确度。同时指出了PCR技术对于环境微生物定量测定的发展前景。黄世旺[8]等建立了定量PCR技术,设计一对引物对其特异性及敏感性等进行了研究,并用副溶血性弧菌、志贺菌等10余种其他肠道细菌进行比对实验,其检测灵敏度高达10CFU/ml,明显高于常规PCR的检出限90CFU/ml,整个实验过程只需2h。2008年,美国的Yang[9]针对16SrRNA基因保守取设计通用引物,用实时PCR先进行宽范围扩增,再进行革兰分型及种特异性检测。对121份脓毒性关节炎患者的滑膜液进行检测,对所有细菌保守序列检测的敏感度为10CFU/mL,36种常见脓毒性关节炎有关菌种特异的探针进行革兰分型和种特异检测,敏感度和特异度是传统方法的95%和97%,革兰分型符合率是100%,从收到标本到出结果花费3h的时间。2.4免疫-PCR的应用免疫PCR技术是1992年,SanoT.等建立的检测微量抗原的高灵敏度技术[10]。该技术将血清学中抗原抗体反应,与聚合酶链反应特异扩增一段DNA分子的技术结合起来,用一段具体的DNA分子标记抗体,应用此抗体去检测抗原,PCR扩增此段DNA分子,电泳定性,根据此段DNA分子是否存在,来显示抗原是否存在。其一般程序如下:在酶联板内包被捕获抗原的抗体,加入待检测抗体,温育后充分洗涤,PCR扩增粘附在抗体/抗原复合物上的DNA分子,电泳显示结果。在病毒感染的检测方面,有许多研究人员利用免疫PCR技术对病毒感染进行了检测。Kakizald[11]等报道T在感染的是脚鱼(serioladumem劝中运用免疫PCR检测病原巴斯德氏菌,结果表明利用它可检测出34cf/m的病原菌,而对照使用的ELISA方法只能检测出3.4xl04cf/ml的菌。McKie[12]等对血清中腮腺炎病毒的特异性抗体进行了检测。在细菌检测方面。Huang[13]等建立了检测金黄色葡萄球菌的高灵敏度的免疫PCR方法。Monteiro[14]等将磁珠技术和免疫PCR技术相结合,设计了一种能检测粪便中幽门螺杆菌的新方法。王中民[15]等利用链亲和素和生物素之间的高度亲和力,采用生物素化羊抗鼠IgG作二抗,将单抗与DNA相连接,建立免疫PCR检测方法,用以检测颗粒性抗原细菌,并与ELISA方法进行了比较。2.5套式引物PCR的应用套式引物PCR一般是在扩增更大片断的目的DNA时采用,即先用非特异性的引物进行扩增,然后再用特异性引物对第一次PCR扩增的产物进行带二次扩增,以获得可供分析的目的DNA。夏春[16]等根据鱼源嗜水气单胞菌p溶血素基因序列设计了两对引物,采用套式PcR法证实了我国嗜水气单胞菌流行株亦存在p溶血素的基因,并建立了PCR检测产β溶血素嗜水气单胞菌的方法。Glukhov[17]等以操纵子ctxAB基因DNA区的引物进行套式PCR检测霍乱弧菌(V.cholera)产毒株霍乱毒素基因,具有极高的灵敏度和特异性。2.6多重PCR的应用多重PCR(Multiplexpolymerasechainreaction)又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。最早由Chamberlian等于1988年首次提出来,目前已被广泛应用于医学及生物领域,包括基因敲除分析、突变、多态性分析、定量分析、RNA检测及微生物耐药检测等,不仅是科研的主要手段,也具有很高的实用价值。影响多重PCR的因素有很多,其中Mg2+的浓度很关键,所以在引物设计相对特异的前提下,实现对多重PCR体系中各条件的摸索,尤其是Mg2+浓度的优化,是建立起高效、准确的多重PCR检测体系的必然过程。多重PCR是在同一反应体系中同时加人多对引物,在同一个反应管中同时扩增多个目的基因,其优点是可以同时检测多种病原体,从而节省检测的时间和资金。李晨[18]等根据目前水产上常见病原菌鳗弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌的毒力相关基因,选择具有特异性的鳗弧菌调控毒力蛋白表达的基因、嗜水气单胞菌中重要的编码气溶素基因aerA、迟缓爱德华氏菌中编码分泌系统装置蛋白的基因evpA,分别设计1对特异性引物,建立可同时特异性地检测3种菌的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并测试了其特异性和灵敏度。梁会营[19]等建立婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法。根据阪崎肠杆菌外膜蛋白A(ompA)基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因序列,设计两对特异性引物。对反应条件进行优化,建立针对婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法,并对奶粉进行模拟检测。两对引物能特异扩出282bp和482bp的目的条带;在优化条件下,可同时检测模拟样品中两菌DNA,灵敏度达到103CFU/ml。2.7、巢式PCR的应用巢式PCR(nestedPCR,nPCR)是一种变异的聚合酶链反应,使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部,使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于,如果第一次扩增产生了错误片断,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此,巢式PCR的扩增非常特异。王伟平[20]等探讨巢式酶链聚合反应(PCR)技术快速检测泌尿生殖道致病性支原体在临床上的应用。以支原体16S~23S保守区域基因为扩增靶序列设计通用引物,采用巢式PCR方法扩增微小脲原体(Up)、解脲脲原体(Uu)、生殖支原体(Mg)和人型支原体(Mh)4种支原体。巢式PCR检测灵敏度高于一步PCR(χ2=5.857,P<0.05),巢式PCR扩增出4种支原体的标准株,对1份生物样品可同时检测出4种致病性支原体,避免了误诊、漏诊,提高诊治效率。姜敏[21])等评价巢式聚合酶链反应(nested-PCR)技术在b型流感嗜血杆菌(Hib)检测中的应用价值,估计氨苄西林耐药Hi中b型的比率。对2000—2003年北京、上海、广州细菌监测项目中,呼吸道感染儿童鼻咽部分离培养的899株Hi,用E试验法检测氨苄西林耐药情况后,用nested-PCR与玻片凝集法对氨苄西林耐药菌株进行b型检测。检出74株氨苄西林耐药Hi。nested-PCR与玻片凝集法检测Hib的结果一致,74株氨苄西林耐药Hi中有2株为Hib,约占2.7%。nested-PCRb型荚膜检测方法可作为玻片凝集法的一个重要补充。3、结语聚合酶链反应以其敏感、特异、快速等特点广泛应用于病原菌的检测中。PCR不仅自身可以用来检测病原体,也可以与其他技术相结合充分发挥其优点。例如,鲁卫平[22]等人结合纳米金新型基因芯片检测系统,构建采用通用引物的一次PCR法实现一次对多个临床常见致病性酵母菌的检测分析。通过PCR与其他技术的联用可以解决了一些技术上的难题。通过PCR技术的不断完善以及与其他新技术的联合应用,PCR及其衍生技术在病原微生物的检测中将有非常好的应用前景。且随着分子生物学及其相关技术的发展,PCR技术的不足会逐渐得到改进,将会成为未来分子生物学实验室必备的研究工具,广泛应用于微生物检测等诸多领域。参考文献[1]彭宣宪,高华,王三英.等.采用通用引物PCR配合SSCP和RFLP技术检测鱼病病原菌[J].水产学报,2000,24(4):345-348.[2]李业鹏,钟凯,杨宝兰,等.食品中沙门菌PCR检测方法的建立[J].中国食品卫生杂志,2006,18(1):17-22[3]LinCS,LuMW,TangL,etal.Charaeterizationofviruslikepartielesassembledinarecombinantbaculovirussystemex2pressingthecapsidproteinofafishnodavirus[J].Virology,2001,290(l):50-58.[4]江育林,高隆英,史秀杰,等.用RT-PCRR快速检测Taura综合症病毒阴.检验检疫科学,2004,14(2):8-9.[5]包红梅,王秀荣,陶启蒙,蔡东东,王馥梅,赵玉辉,陈化兰.H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立.中国兽医科学,2010,40(04):384-389[6]SchmittgenTD.Real-timequantitativePCR[J].Methods,2001,25(4):383-385.[7]HilaryABrooks,RichardMGersberg,ArunKDhar.De-tectionandquantificationofhepatitisAvirusinseawaterviareal-timeRT-PCR[J].JournalofVirologicalMethods,2005,127(2):109-118.[8]黄世旺,卢亦愚,徐丹戈,等.TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌的方法建立[J].中国卫生检验杂志,2006,16(8):923-924.[9]YangS,RamachandranP.RapidPCR-baseddiagnosisofsepticarthritisbyearlyGram-typeclassificationandpathogenidentification[J].JClinMicrobio,l2008,46(4):1386-1390[10]SanoT,SmithCL,CantorCR.Science,1992;258(5079):120-122[11]KakizaldE,MiyoshiSI.Detectionofbaeterialantigensusingimmuno-PCR[J」.LettApplMicmbiol,1996,23(2):101-103.[12]McKieA,SamuelD,CohenB,etal.Developmentofaquantitativeimmuno-PCRassayanditsusetodetectmumps-specificIgGinserum.JImmunolMethods,2002,261(1-2):167-175[13]HuangSH,ChangTC.DetectionofStaphylococcusaureusbyasensitiveimmuno-PCRassay.ClinChem,2004,50(9):1673-1674.[14]MonteiroL,GrasN,MegraudF.Magneticimmuno-PCRassaywithinhibitorremovalfordirectdetectionofHelicobacterpyloriinhumanfeces
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