医学培训课件 第12章 固相膜免疫测定

第十二第一节概述一、免疫测定分类二、免疫测定原理三、固相免疫测定四、固相膜的特点五、常用的固相膜六、固相膜的技术要求第十二章固相膜免疫测定第二节免疫金标记技术一、胶体金的制备第三节膜载体免疫测定的种类与原理一、膜固相免疫测定的特点二、固相微孔膜测定种类三、免疫渗滤试验和免疫层析试验四、酶联免疫斑点试验五、免疫印迹六、放射免疫沉淀试验思考题小结随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。

第一节概述标记免疫测定放射免疫测定1960’酶免疫测定1970’荧光免疫测定1980’－1990’化学发光免疫测定1990’－膜固相免疫测定1990’－一、免疫测定分类免疫浊度测定Ag+Ab

AgAb+Ab标记免疫测定

Ag+Ab*AgAb*+Ab*

（B）（F）二、免疫测定原理利用抗原抗体反应检测标本中微量物质抗原+抗体抗原抗体复合物

Ag+Ab

Ag*Ab三、固相免疫测定B与F分离

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*

Ab

Ab四、固相膜的特点多孔性

毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作简便五、常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜六、固相膜的技术要求孔径：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示均一性固相NC膜第二节免疫金标记技术(Immunogold

labelling

techique)

是以胶体金作为标记物的免疫标记技术。基本原理用金溶胶标记蛋白质，胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的定位或定性。胶体金（colloidalgold）指金微小粒子（1－100nm）分散在溶液中所形成的金溶液。是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。也称金溶胶（goldsolution）。技术类型：1.金免疫测定技术

2.金免疫组化技术一、胶体金制备

胶体金（colloidalgold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液。

胶体金的制备方法

原理：向一定浓度的氯金酸溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。

配HAuC14水溶液加热沸柠檬酸三钠搅动加热沸（约2～3min*）冷却加蒸馏水至原体积。见淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。通过改变柠檬酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒

胶体金的制备及特性胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙红色522411.00红色52571.50.70紫色535*还原100ml0.01%HAuCl4所需量

制备胶体金的注意事项（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，不应使用金属药匙称量氯金酸。（3）制备胶体金应用双蒸/三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。（4）玻璃容器必须是绝对清洁的，最好是经硅化处理的。

胶体金的保存洁净的玻璃器皿中可较长时间保存；少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。胶体金的鉴定：肉眼、分光光度计、电镜等方法观察应为清亮透明的液体若胶体金混浊或液体表面有漂浮物，则制备的胶体金有较多的凝集颗粒胶体金（ColloidalGold）

15~60nm优质劣质免疫金的制备免疫金（immunogold）：是指胶体金与抗原或抗体等的结合物,在免疫组织化学技术中，习惯上要称之为金探针。制备方法：

1.胶体金溶液的pH值调整

2．蛋白质最适标记量的确定

3．标记过程

4．离心去除未结合的蛋白质，反复洗涤2～4次

5.免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存

胶体金结合物（Conjugate）膜固相免疫测定的特点第三节膜载体免疫测定的种类与原理优点不足之处简便，快速敏感度略低，价格略高（与ELISA比）单份测定精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志；心肌标志；滥用药物固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫层析试验（immunochromatographyassay,ICA）斑点ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶联免疫斑点试验(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印迹法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

一、斑点金免疫渗滤试验

（dotimmunogodl

fitration

assay,DIGFA

原理：将抗原或抗体点加在固相载体NC膜上，制成的包被微孔滤膜贴置于吸水材料上，依次滴加在膜上的标本、免疫金、及洗涤液等液体很快渗入吸水材料中，最后阳性反应在膜上呈现红色斑点。

特点：快速、简便、经济、无需特殊设备、已成为床边检测的主要方法之一。技术要点：技术类型：①双抗体夹心法Ab

＋Ag（标本）＋金标抗体洗涤膜中央形成红色斑点

②间接法Ag＋Ab（标本）洗涤＋金标抗抗体洗涤膜中央形成红色斑点一、免疫渗滤测定(IFA)操作示意图装置分解图盖微孔膜吸水垫料底

DIGFA原理图（三）技术要点1.试剂盒组成滴金反应板、塑料小盒、吸水垫料、包被了抗原或抗体的硝酸纤维素膜、胶体金标记物、洗涤液2.操作要点孔内滴加标本，待完全滲入。孔内滴加胶体金标记抗体，待完全滲入。孔内滴加洗涤液，待完全滲入。膜中央呈现红色或粉红色斑点为阳性。斑点深浅相应提示阳性强度。IFA——双抗体夹心法测抗原AB加尿样AC

阴性

阳性加胶体金标记抗体C

斑点金免疫渗滤试验(IFA)除去滤器BD加洗涤液加尿样A加尿样AGIFA技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相抗原待测抗体金标记抗人IgG抗体人IgG固相抗人IgG抗体快速检测（渗滤法）原理图IFA——结果判断特点

NC膜对蛋白类物质有很强的吸附作用，容易使Ag或Ab包被，封闭后，加待检标本、酶标Ab、酶不溶性底物，阳性标本呈斑点显色。原理是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合，以微孔滤膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。滴加在膜一端的标本液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果。二、免疫层析测定immunochromatography

assay,ICA

ICA技术类型

①双抗体夹心法

②竞争法

③间接法技术要点临床应用及评价

①灵敏度不及酶标法和发光免疫测定法

②只能定性，不能作定量测定

③有“床边检验”之称

④用于正常体液中不存在或含量少物质的测定ICA试剂条样品垫结合物垫NC膜吸水垫DICA双抗体夹心法原理图金标抗体包被抗体抗金标抗体吸水纸标本？？（三）技术要点1.试剂盒组成：胶体金层析条2.原理：斑点金免疫层析双抗体夹心法3.操作要点：斑点金免疫层析试验（一）包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG单抗金标鼠抗HCG单抗尿液浸湿标志线

手持端包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG单抗金标鼠抗HCG单抗尿液浸湿标志线

手持端尿样阳性弱阳性阴性无效斑点金免疫层析试验（二）DICA竞争法原理图金标抗体包被抗原抗金标抗体吸水纸阳性结果标本？？？？ICA——间接法测抗体ICA结果观察

阳性阴性无效DICA间接法原理图窗吸水材料金标抗人IgG吸水材料吸水材料标本加样区包被抗原为了消除待测标本中非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标抗人IgG，故测抗体常用“反流免疫层析法”①②标记线③④⑤合上检测盒⑥⑥液体流动方向IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存4~8℃6个月室温一年操作步骤3~51观察时间3min3~20min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA横流（LATERALFLOW）GIFA技术的发展第一代

1988HIVCHEK（DuPont）单点，5~10分钟，血清，金标试剂瓶装冻干品改进抗原HIV1+2，提高敏感度和特异性，缩短反应时间，减少步骤，样品多样化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22点（测试+控制）金标试剂：单人份、液体样品：血清、血浆、全血、尿液第九~十二代研制中单一试剂ICA技术的发展1990年ABBOTT公司胶体硒标记ICA

Unipath公司CLEARVIEW立明衣原体彩色胶乳标记ICAROCHECardiacReader

TnT

定量0.1~3ng/ml

合成TnT质控点IFA肌红蛋白双孔法

S：测定孔

C：定量质控

100μg/LIFA微量白蛋白单孔法

T：测定孔

C1：定量质控30mg/LC2：定量质控200mg/L

结果判定：（-）<30（+）30~100、（++）

100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）参考值：30μg/L肝癌诊断值：>400μg/L结果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1测定线对照线半定量测定临床应用及评价方法评价：

1.操作简便、快捷、操作人员无需技术培训、不需特殊设备、试剂稳定、便于保存，特别符合“床边检验”。

2.灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法

3.不能准确定量，只能定性或半定量。

4.目前主要用于正常体液中不存在的物质（传染病抗原或抗体、毒品等）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质的检测。如：HCG、AFP三、斑点酶免疫吸附试验

——Dot-ELISA三、斑点—酶联免疫吸附试验斑点—酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）属于ELISA类型，与前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素（NC膜）作为固相载体。技术类型和方法要点1、间接法——测抗体NC膜+已知抗原干燥封闭加待测血清+酶标抗抗体洗涤加底物2、夹心法——测抗体NC膜+待测血清干燥封闭加特异性抗原+酶标抗体洗涤加底物3、双抗体夹心法——测抗原NC膜+特异性抗体干燥封闭加待测血清+酶标抗体洗涤加底物4、直接法——测抗原NC膜+待测血清干燥封闭加酶标抗体洗涤加底物有染色斑点（+）无染色斑点（—）有染色斑点（+）无染色斑点（—）有染色斑点（+）无染色斑点（—）1~2ul2~5ul1~2ul2ul有染色斑点（+）无染色斑点（—）方法评价①操作简便快速，结果判定不需特殊设备，适合基层使用。②特异性强，敏感性较ELISA高6~8倍③试剂用量少，较ELISA节约5~10倍④检测结果可长期保存，利于复查；⑤本法只能做定性分析，不能做定量测定。四、酶联免疫斑点试验

——ELISPOT20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。

ELISPOT检测原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过CTL公司生产的ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。ELISPOT分析仪解决以下问题哪些斑点是抗原特异性T细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有T细胞研究价值）斑点大小的意义在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸如何从单个细胞基础上分析实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？几次重复实验才能使结果更有意义？E