实验二十二 动物寄生虫病的Dot-ELISA法诊断技术

实验二十二动物寄生虫病Dot-ELISA法诊断技术斑点ELISA（Dot-ELISA）是在常规ELISA方法的基础上发展起来的，1982年Hawks等及Herbrind等以硝酸纤维素膜(NC膜)为固相载体几乎同时建立了Dot-ELISA检测法，保留了常规ELISA特异、敏感、经济、快速、可自动化等优点，而且NC膜具有更好的吸附能力(可100%吸附)，用离子型去污剂裂解的抗原也能很好地吸附，从而使该方法迅速得到推广，被认为是传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前途的新技术之一。以硝酸纤维膜（NC膜）代替聚苯乙烯板，在膜上滴加抗原或抗体，封闭后，按常规ELISA实验操作，最后用不溶性底物显色，一般是二氨基邻笨胺（DAB），其氧化产物为不溶的棕色产物，根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量。斑点ELISA方法具有以下优点：特异性强，假阳性少；由于NC膜对蛋白质的吸附能力优于聚苯乙烯，故其敏感性比常规ELISA高6-8倍；试剂用量少，比常规ELISA至少节约10倍；抗原膜保存期长，-20℃可保存半年；检测结果可长期保存；操作简便，不需特殊仪器（酶联检测仪）。此法简易快速，便于推广，目前已广泛用于多种寄生虫病的诊断和监测，如弓形虫病、包虫病、囊虫病、捻转血矛线虫病、血吸虫病、华枝睾吸虫病、旋毛虫病等抗原或抗体的检测。一、实验目的及要求了解Dot-ELISA的原理和基本操作过程。二、实验器材1．器材。硝酸纤维膜（NC膜）或聚氯乙烯（PVC）白色薄膜凹孔板、微量加样器、滤纸、玻璃皿等。2．0.01mol/LPBS(pH7.4)。KH2PO40.2gNa2HPO4•12H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g蒸馏水加至1000ml3．Tris缓冲液的配制。0.05MTBS(pH7.4)的配制：Tris（三羟甲基胺基甲烷）12.1gNaCl17.5g蒸馏水加至1500ml磁性搅拌下滴加浓HCl至pH为7.4，再加蒸馏水至2000ml。4．封闭液。为2%BSA的0.01mol/LpH7.4的PBS等。5．PBST洗涤液。为0.5%Tween-200.01mol/LpH7.4的PBS。6．底物溶液。二氨基联苯胺（DAB）：0.05%DAB+0.3%H2O2；4-氯-1萘酚：用甲醇配制0.3%母液，4℃保存，用前取1ml母液加0.05mol/LTBS5ml，再加30%H2O210ul。7．酶标抗体。辣根过氧化物酶标记抗体、酶标二抗或辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白（SPA）。三、实验方法、步骤和操作要领（一）直接法测抗原（以检测血吸虫循环抗原为例）1．原理。将待检血清点在NC膜上，如血清中含日本血吸虫循环抗原则包被在NC膜上形成固相抗原，加入酶抗记的抗血吸虫单克隆抗体，与固相抗原形成抗原-酶标抗体复合物，再加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色，由于每步之间均有冲洗步骤，因此，若样品中不含有血吸虫循环抗原，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。2．操作方法。具体操作如下：取适当大小NC膜，用铅笔画或使用点膜器制备直径5mm的加样孔，并作好相应标记。将NC膜浸入到0.01mol/LpH7.4的PBS中15～30min，取出用滤纸吸干。将对照阳性血清、阴性血清和待检血清分别点加于加样孔内，室温干燥。将NC膜浸入封闭液中振摇封闭30min。将NC膜浸入洗涤液中振荡洗涤3次，每次5min，取出用滤纸吸干。将NC膜浸入单克隆酶标抗体溶液中，振摇反应30min。重复步骤5。将NC膜浸入底物溶液中，振摇显色10～20min。用流水冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应。3.判定标准。根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量：斑点呈深褐红色为+++，褐红色为++，浅褐红色为+，无色为阴性。（二）间接法测抗体（以检测旋毛虫病抗体为例）1．原理。将特异性抗原点在NC膜上，干燥形成固相抗原，加入待检血清，如血清中含有抗旋毛虫特异抗体，则与固相抗原形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗抗体（或酶标SPA），与上述抗原-抗体复合物结合。此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色（反应过程见图22-1）。由于每步之间均有冲洗步骤。因此，若待检血清中不含相应的抗体，酶标抗体将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。固相AgAbAg-Ab结合物酶标抗AbAg-Ab-抗Ab-酶复合物图22-图22-1间接法Dot-ELISA反应原理图2．操作方法。具体操作如下：(1)抗原的制备。收集纯净的浓集旋毛虫幼虫，经研磨至显微镜下观察不到虫体碎片，反复冷浸，离心沉淀，弃去沉渣。再经水浴离心后，呈乳白色的上清液即为抗原。使用时以Tris-HCl缓冲液（pH7.4）进行适当稀释。(2)将NC膜浸入到0.01mol/LpH7.4的PBS中15～30min，取出用滤纸吸干。(3)取适当大小NC膜，用铅笔画或使用点膜器制备直径5mm的加样孔，并作好相应标记。(4)将抗原点加于加样孔内，室温干燥。(5)将NC膜浸入封闭液中振摇封闭30min。(6)将NC膜浸入洗涤液中振荡洗涤3次，每次5min，取出用滤纸吸干。(7)将NC膜浸入一定稀释度的待检血清中溶液中，同时做阳性和阴性血清对照，振摇反应30min。(8)重复步骤6。(9)将NC膜浸入一定稀释度的酶标二抗（或酶标SPA）溶液中，振摇反应30min。重复步骤6。将NC膜浸入底物溶液中，振摇显色10～20min。用流水冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应。3.判定标准。根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量：斑点呈深褐红色为+++，褐红色为++，浅褐红色为+，无色为阴性。（三）白色PVC载体快速Dot-ELISA（以检测肺吸虫抗体为例）1．原理。以聚氯乙烯（PVC）白色薄膜凹孔板代替NC膜为载体进行Dot-ELISA，能克服NC试验的一些不足之处，有如下优点：待测血清直接在PCV孔内稀释、试验一次完成，减少血清稀释及加样误差；PVC载体为平底凹孔板，洗涤方便、快速；试剂用量少，试验成本低；试验时间短。目前已被用于肺吸虫病、日本血吸虫病、华枝睾吸虫病、囊尾蚴病等寄生虫病的研究。2．操作方法。以检测肺吸虫抗体为例，具体操作如下：（1）抗原的制备。从人工感染卫氏并殖吸虫囊蚴的犬肺内获取肺吸虫成虫，用无菌生理盐水洗涤数次、冻干、研磨、超声粉碎、离心，上清液测定蛋白含量，低温贮存备用。（2）将抗原点加在孔径为1cm的白色PVC板孔内，室温干燥。（3）加入封闭液每孔100ul，37℃封闭30min。（4）洗涤。弃孔内液体，PBS快洗一次，自来水快洗5次。（5）加一定稀释度的待检血清100ul，同时做阳性和阴性血清对照，37℃作用10min。（6）重复步骤4。（7）加适合稀释度的酶标二抗（或酶标SPA）溶液100ul，37℃作用10min。（8）重复步骤4。（9）加底物溶液4ClN-H2O2每孔100ul室温显色3～5min。（10）用流水冲洗数分钟终止反应。3.判定标准。根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量：阳性孔中心出现浅紫色斑点并与阳性对照一致，阴性无色或呈现浅灰色环状斑点。四、实验注意事项1．包被用的抗原或抗体的蛋白浓度最好是预先经过方阵法滴定选择其最佳工作浓度。2．可选择多种封闭液，如2%BSA、0.5%明胶PBST溶液、10%小牛血清、0.5%的脱脂奶粉等。3．实验时NC膜可置于玻璃皿、血凝板孔内或其它容器里反应。4．底物现配现