DB37T4754.1动物疫病鉴别检测技术　第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒

Q/LB.□XXXXX-XXXXDB37/T4754.1—2024前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是DB37/T4754《动物疫病鉴别检测技术》的第1部分。DB37/T4754已经发布了以下部分：第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。引言动物疫病是影响山东省畜牧业健康发展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基因型引起疫病的临床病症具有一定程度的相似性，一些疫病弱毒疫苗的使用也干扰了病原的检测。动物疫病鉴别检测技术标准的建立，规定了对不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗株的鉴别检测，为山东省动物疫病精准防控提供了技术支持，对于促进畜牧业健康发展具有重要意义。猪瘟病毒（Classicalswinefever，CSFV）属于黄病毒科瘟病毒属成员，是引起猪瘟的病原体。猪瘟严重危害养猪业，世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病之一，我国将其列为二类动物传染病。猪是猪瘟病毒的唯一宿主。在自然条件下，病毒经口腔和鼻腔途径进入宿主，也可通过损伤的皮肤或伤口感染，感染的猪在潜伏期便可排出病毒，病毒随病猪的分泌物和排泄物污染的饲料和饮水进入机体。我国从20世纪50年代便开始广泛应用兔化弱毒疫苗做预防注射，在控制猪瘟中起到重要的作用，随着养猪业的不断发展，集约化养猪场规模越来越大，国内生猪的交易和流通日趋频繁，给猪瘟的防制带来了挑战。各地猪瘟仍时有发生，而且多表现为非典型、慢性及隐性状态，并出现猪瘟病毒的持续感染和妊娠母猪带毒综合征。这给兽医临床诊断带来了很大困难。中国猪瘟弱毒疫苗的全面应用，使生猪携带猪瘟疫苗毒成为常态，导致常规的猪瘟病毒核酸检测难以区分猪瘟病毒的强毒感染和免疫接种的疫苗弱毒，迫切需要建立一种快速、特异的标准技术来区分猪瘟强毒和猪瘟疫苗弱毒，为保障我省养猪业的健康发展发挥引领和示范作用。本标准制定后，作为《动物疫病鉴别检测技术》的1部分，《动物疫病鉴别检测技术》拟由以下部分构成。第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒。目的在于规范猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒SYBRGreenI荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在猪瘟临床诊断、流行病学调查、检验检疫、猪瘟疫苗质量控制等方面的稳定应用。第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型。目的在于规范兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型实时荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在兔瘟临床诊断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定应用。第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群。目的在于规范禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在禽腺病毒病临床诊断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定应用。动物疫病鉴别检测技术第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒范围本文件规定了猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒SYBRGreenI荧光RT-PCR鉴别检测。本文件适用于猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒的鉴别检测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。试验原理本文件通过特异性引物，在RT-PCR反应体系中扩增出了猪瘟疫苗弱毒126bp及猪瘟强毒335bp的目的产物，当SYBRGreenI荧光染料与扩增产物结合时，荧光信号增强，从扩增产物上释放出来时，荧光信号急剧减弱，不同DNA扩增产物，Tm值不同，通过Tm值的差异及荧光信号的变化实现了猪瘟疫苗弱毒与猪瘟强毒扩增产物的鉴别。SYBRGreenI是一种只与双链DNA小沟结合的染料。试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂。水：GB/T6682，一级。焦碳酸二乙酯（DEPC）水。取1 mLDEPC加入水至1 000 mL，充分震荡混匀，静置24 h后，121 ℃高压灭菌15 min，2 ℃～8 ℃保存备用。磷酸盐缓冲溶液（PBS）。取Na2HPO4.12H2O2.9 g，KCl0.2 g，KH2PO40.2 g，NaCl8 g，溶于800 mL水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，加水定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min，2 ℃～8 ℃保存备用。氢氧化钠溶液（3%）。称取3 g氢氧化钠，溶于少量水中，放置室温后，加水定容至100 mL。乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（4%）。称取4 g乙二胺四乙酸二钠，加水定容至100 mL。引物：引物名称和序列见附录A。商品化病毒核酸提取试剂盒。商品化一步法荧光RT-PCR反应试剂。猪瘟疫苗弱毒阳性对照：市售商品化猪瘟兔化弱毒疫苗（传代细胞源）。猪瘟疫苗弱毒阴性对照：DEPC水。猪瘟强毒阳性对照：含有猪瘟强毒株扩增目的基因的阳性质粒。猪瘟强毒阴性对照：DEPC水。饮用水：清洁、无异味，pH值在6.5～8.5之间。仪器设备二级生物安全柜。荧光PCR检测仪。电子天平：精度0.01 g。高速冷冻离心机：转速≥12 000 r/min。瞬时离心机：转速≥6 000 r/min。低温冰柜：-70 ℃以下。高压蒸汽灭菌器。干热灭菌器。样品采样工具扁桃体采样器：鼻钳子、开口器和采样枪。使用前均用3%的氢氧化钠溶液浸泡消毒5 min～10 min，饮用水流水冲洗2 min。剪子、镊子经160 ℃干热灭菌2 h。采样采样要求：采样过程按照NY/T541执行，采样及样品处理过程中应戴一次性手套，样品间不得交叉污染。扁桃体样品：鼻钳子固定活猪上颚，用开口器打开口腔，用采样枪采集扁桃体，灭菌牙签挑至1.5 mL离心管，编号标记。内脏样品：采集病死或安乐死的猪、兔各种内脏器官（脾脏、淋巴结、肾脏、肺脏、盲肠等）装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号标记。全血样品：用无菌注射器采集全血，注入含有1/10体积4%的EDTA溶液的无菌容器内，充分混匀后编号备用。排泄物样品：用棉拭子挑取少许新鲜粪便样品于离心管内，加入1 mLPBS，震荡混匀，编号标记。细胞培养物：取1 mL细胞培养物置于离心管内，编号标记。疫苗样品：随机抽取猪瘟活疫苗样品3瓶，分别加入2 mLPBS，溶解，编号标记。样品的运输及保存运输：采集的样品密封后，采用保温箱加冰密封，在2 ℃～8 ℃条件下24 h内运送到实验室。保存：采集的样品在2 ℃～8 ℃条件下保存，时间不超过24 h；-20 ℃不超过3个月，-70 ℃不超过5年。试验步骤样品处理扁桃体样品：样品加入5倍体积4 ℃预冷的DEPC水，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清液转入离心管中编号备用。内脏样品：样品加入5倍体积4 ℃预冷的DEPC水，充分研磨，4 ℃、10000r/min离心5 min，取上清液转入离心管中编号备用。排泄物样品：4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清液0.5 mL转入离心管中编号备用。细胞培养物：10 000 r/min离心5 min，取上清液0.5 mL转入离心管中编号备用。疫苗样品：10 000 r/min离心5 min，取上清液0.5 mL转入离心管中编号备用。全血样品：全血样品可直接用做核酸提取。核酸抽提进行猪瘟病毒检测时，生物安全按照GB19489执行，采用商品化试剂盒提取病毒核酸。荧光RT-PCR检测反应体系的配制反应体系的配制见附录B。加样在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入阳性对照、阴性对照和提取的试样溶液2 μL，盖紧管盖，混匀，瞬时离心1 min。测定参考仪器参数，选择SYBRGreenI荧光通道。参考扩增条件：第一阶段，42 ℃反转录5 min；第二阶段，95 ℃预变性10 s；第三阶段，95 ℃变性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。72 ℃时设置采集荧光。第四阶段，溶解曲线分析，60 ℃1 min，以0.1 ℃/s的速率升温，直到97 ℃，整个过程连续采集荧光，绘制扩增产物的熔解曲线。结果判定质控标准猪瘟病毒疫苗弱毒阴性对照：无Ct值，无典型扩增曲线，在熔解曲线Tm值为81.5 ℃±0.5 ℃范围内未出现熔解峰。阳性对照：Ct值＜30.0，并出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值在81.5 ℃±0.5 ℃出现熔解峰，参见附录C（图C.1）。若阴、阳性对照组结果不成立，则视为无效检验。猪瘟病毒强毒阴性对照：无Ct值，无典型扩增曲线，在熔解曲线Tm值在83.3 ℃±0.9 ℃范围内未出现熔解峰。阳性对照：Ct值＜30.0，并出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值在83.3 ℃±0.9 ℃出现熔解峰，参见附录C（图C.2）。若阴、阳性对照组结果不成立，则视为无效检验。阴阳性结果的判定猪瘟病毒疫苗弱毒若检测样品无Ct值并且无典型的扩增曲线，在熔解曲线Tm值为81.5 ℃±0.5 ℃范围内未出现熔解峰，则判为猪瘟病毒疫苗弱毒核酸阴性。若检测样品Ct值≤30.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值为81.5 ℃±0.5 ℃出现熔解峰，则判为猪瘟病毒疫苗弱毒核酸阳性。若检测样品30.0＜Ct值≤35.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值为81.5 ℃±0.5 ℃出现熔解峰，则判为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为猪瘟病毒疫苗弱毒核酸阳性，否则为阴性。猪瘟病毒强毒若检测样品无Ct值并且无典型的扩增曲线，在熔解曲线Tm值为83.3 ℃±0.9 ℃范围内未出现熔解峰，则判为猪瘟病毒强毒阴性。若检测样品Ct值≤30.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值在83.3 ℃±0.9 ℃出现熔解峰，则判为猪瘟病毒强毒核酸阳性。若检测样品30.0＜Ct值≤35.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值在83.3 ℃±0.9 ℃出现熔解峰，则判为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为猪瘟病毒强毒核酸阳性，否则为阴性。

（资料性）

引物引物名称和序列见表A.1。引物名称和序列引物名称引物序列（5′—3′）猪瘟病毒疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT猪瘟病毒疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT猪瘟病毒强毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT猪瘟病毒强毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA引物用DEPC水溶解并稀释至100 μmol/L后，-20 ℃保存备用；根据需要配制10μmol/L工作液，-20 ℃保存供检测使用。

（资料性）

荧光RT-PCR反应体系配制猪瘟病毒疫苗弱毒荧光RT-PCR反应体系配制见表B.1。猪瘟病毒疫苗弱毒荧光RT-PCR反应体系试剂1个检测反应的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5 μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5 μLExTaqHS（5 U/µL）0.5 μL猪瘟病毒疫苗弱毒上游引物1.0 μL猪瘟病毒疫苗弱毒下游引物1.0 μLRNaseFreedH2O7.5 μL试样溶液2.0 uL总体积25.0 μL猪瘟病毒强毒荧光RT-PCR反应体系配制见表B.2。猪瘟病毒强毒荧光RT-PCR反应体系试剂1个检测反应的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5 μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5 μLExTaqHS（5 U/µL）0.5 μL猪瘟病毒强毒上游引物1.0 μL猪瘟病毒强