一种利用体外产气法检验日粮适合度的方法

2一种利用体外产气法检验日粮适合度的方法本文件规定了日粮适合度检验的仪器和设备、试样、评定指标及方法。本文件适用于TMR全混日粮适合度评定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1日粮适合度检验testingforrationfitness一种利用体外批次培养、瘤胃液和发酵产气技术并结合数学曲线剖分技术，对动物所采食日粮进行品质和组合效应分析，解构蛋白质和碳水化合物的快速和慢速降解池，评价微生物蛋白产量和发酵效率，检验日粮适合度的方法。4仪器和设备4.1实验室用样品粉碎机或研钵。4.2瘤胃液取样器（长30cm，内径12.70mmPPR管）。4.3分析天平（分度值0.0001g）。4.4烘干箱（室温～300℃)。4.5磁力搅拌器（转速为100～1400r/min）。4.6纤维袋（ANKOMF57，25μm孔隙）。4.7封口机。4.8纤维分析仪（滤袋结构：25μm孔隙；处理能力：24个/批；测定样品重量：0.5～1.0g）。4.9体外模拟培养箱（滤袋结构：25μm孔隙；处理能力：100个/批；测定样品重量：0.25～1.0g）。4.10体外产气仪（测量方式：累计产气量、设定时段产气量、产气瞬时温度；模块数据传输和感应方式：无线，有效距离至少10米；样品装填单元容量：250ml）。35试样5.1采样按GB/T14699.1进行采样。5.2制备样品根据GB/T20195制备，置于烘箱内于65℃烘干，研磨，过1mm筛。6评定指标及方法6.1CNCPS对蛋白质和碳水化合物组分的剖分康乃尔净碳水化合物和蛋白质体系（CNCPS）根据瘤胃降解特性将饲料中蛋白质分为5个部分，即瞬间可溶性蛋白，PA；不可降解粗蛋白，PC；真蛋白，PB；将PB又分为快速降解真白，PB1；中速降解蛋白，PB2；慢速降解蛋白，PB3。CNCPS将饲料中碳水化合物分为4个组分，即以糖类为主的快速降解碳水化合物，CA；以淀粉和果胶为主要成分的中速降解碳水化合物，CB1；以可消化纤维为主的慢速降解碳水化合物，CB2；以细胞壁为主的不可利用碳水化合物，CC。6.2日粮适合度指标检验6.2.1体外发酵产气快慢池的剖分操作步骤参见附录A，产气快慢池剖分参见附录B。6.2.2有机物质的降解率操作步骤参见附录A。6.2.3比例因子操作步骤参见附录A。6.2.4微生物的生物合成量操作步骤参见附录A。6.2.5微生物生物合成效率操作步骤参见附录A。6.3日粮适合度检验标准6.3.1体外发酵快慢池的产气量体外发酵快慢池的产气量参考范围见表1。4表1快慢池的产气量参考范围平均值参考范围标准偏差TMR快速发酵池(mL)29.516.3—42.76.6<40慢速发酵池(mL)40.923.1—58.78.9~60总产气量(mL)70.542.1—98.880-110诊断意见：1.当快速发酵池产生超过40mL气体时，较多的气体产量可能来自快速消化的B2（可溶性纤维）池，其产生大量的甲烷和二氧化碳气体（以及乙酸盐和较少的ATP用于微生物生长）而不是来自过量的淀粉。在TMR显示相对缓慢的“慢池消化率”时，可能存在考虑添加NFFS源的趋势。然而，这将导致产生更多的气体，并且不会使发酵朝向支持更高的乳产量所需的丙酸盐（谷物，其途径不产生气体）所需的能量。2.日粮总产气量很大时(例如>110mL)，可能表明具有优异的饲草消化率，但由于细菌能量溢出（缺乏可溶性蛋白）或缺乏丙酸盐前体（谷物）而缺乏适合ATP和微生物生产的能量。6.3.2产气快慢池的降解速率产气快慢池的降解速率参考范围见表2。表2产气快慢池的降解速率的参考范围平均值参考范围标准偏差TMRCB1/kd(starch,%/h)8.9—26.94.518-20CB3/kd(NDF,%/h)4.62.4—6.85-6诊断意见：1.当慢速降解部分CB3速率低于5%时，表明粗料有较低的消化率，将会导致能量摄入减少进而影响微生物蛋白合成。可通过增加非饲草纤维来源来提高发酵率。2.当快速发酵部分CB1超过25%/h时，可能会发生瘤胃酸中毒的情况，也会出现蹄部健康问题。可通过饲喂干玉米来替代发酵玉米，或者降低玉米青贮加工的粉碎粒度效果和对谷物的破碎粒度（700-1000微米）等方法来降低瘤胃内的降解速率。6.3.3有机物质的降解率有机物质的降解率参考范围见表3。表3有机物质的降解率的参考范围平均值参考范围标准偏差TMR60.546.1—74.97.2诊断意见：1.当TDOM<50%，牛奶产奶量通常较低，制定日粮配方更具挑战性；2.当TDOM在60%左右，牛奶产量正常，制定日粮配方相对容易；3.当TDOM>65%，牛奶产量较高，但需注意消化率和相对池的大小。6.3.4比例因子5比例因子参考范围见表4。表4比例因子的参考范围平均值参考范围标准偏差TMR4.12.5—5.70.8诊断意见：较高的比例因子的值表明有较少的气体产生和更多的ATP用于微生物的生长。一般来说，较多的气体产生表明乙酸的产量较高，这反过来会导致ATP产量降低。6.3.5微生物的生物合成量微生物的生物合成量参考范围见表5。表5微生物的生物合成量的参考范围平均值参考范围标准偏差TMR135.876.0—195.659.9>1406附录A体外发酵产气操作步骤A.1瘤胃液的制备在晨饲前经瘤胃瘘管利用瘤胃液取样器采集供试羊（牛）的瘤胃液100mL～200mL，直接转入预热至39℃的保温容器中，混合均匀后经4层纱布过滤，滤液持续通入CO2气体，然后量取20mL～30mL瘤胃上清液于39℃保温容器备用。A.2培养液的制备A.2.1矿物质溶液1：二水氯化钙13.2g、四水氯化锰10.0g、六水氯化钴1.0g、六水三氯化铁8.0g，用蒸馏水溶解，冷却后，定容至100mL。A.2.2矿物质溶液2：磷酸氢二钠5.7g、磷酸二氢钾6.2g、七水硫酸镁0.6g用蒸馏水溶解后,定容至1000mL。A.2.3缓冲溶液：碳酸氢钠35.0g、碳酸氢铵4.0g，用蒸馏水溶解，冷却后，定容至1000mL。A.2.4刃天青溶液：用蒸馏水溶解100mg刃天青，冷却，定容至100mL。A.2.5还原剂溶液：准确量取2.0mL的1mol的氢氧化钠溶液、312.5mg九水硫化钠；加入47.5mL蒸馏水即可。需在培养的当天配置。A.2.6缓冲溶液的配制：将矿物质溶液10.12mL、缓冲溶液237.00mL、矿物质溶液2237.00mL以及1.22mL刃天青溶液加入到474.00mL蒸馏水中，温热到39℃后，加入还原剂溶液。A.2.7人工瘤胃培养液配制：将20mL瘤胃上清液与40mL缓冲溶液混合,得到混合人工瘤胃培养液。A.3体外产气量的测定将0.4000g待测样品干物质置于ANKOMRFS产气测量系统的产气瓶中，用60mL人工瘤胃培养液消化。每个培养设3个重复，通过无线传输连接多个容器，仪器自动检测并在电子表格中记录气压信息。同一批次培养中设定空白组，即为无发酵底物，仅有瘤胃液和培养液，作为产气量校正。A.4体外发酵产气快慢池的剖分根据不同时间点的产气量，采用Logistic-dualpool模型公式对快慢池产气量进行剖分:V(t)＝Vf1/(1+exp(2-4k1(t-L)))+Vf2/(1+exp(2-4k2(t-L)))式中：V(t)——t时间的产气量，单位为毫升（mL）；Vf1——来源于快速降解的可溶部分产生的产气量，单位为毫升（mLVf2——来源于慢速降解的不溶部分产生的产气量，单位为毫升（mLk1——降解的可溶部分的产气速率，单位为百分比每小时（%/hk2——降解的不溶部分的产气速率，单位为百分比每小时（%/hL——延迟时间，单位为小时（h）；t——产气时间点，单位为小时（h）。A.5有机物质降解率的测定7A.5.1操作步骤试验结束后将产气瓶于冰上冷却，将内容物转移到离心管中，3500转离心15min，弃上清液，将残渣转移到坩埚中，105℃烘干至恒重，然后放到550℃的马福炉中灼烧4h后，称重，直至恒重。A.5.2计算公式A.5.2.1试样中有机物质的降解率以质量分数(mg/g)表示，按式（A.1）计算。TDOM=（W1-W2）-（W3-W4）/（W1-W2）×1000……………（A.1）式中：TDOM——试样中24小时后的有机物质的降解率，单位毫克每克（mg/gW1——原样和坩埚的重量，单位克（gW2——原样灰化后和坩埚的重量，单位克（gW3——残渣烘干后和坩埚的重量，单位克（gW4——烘干的残渣灰化后和坩埚的重量，单位克（g）。A.6比例因子的测定A.6.1计算公式试样中比例因子以体积分数(mg/ml)表示，按式（A.2）计算。PF=Y/X……………（A.2）式中：PF——试样中比例因子，单位为毫克每毫升（mg/mL）；Y——试样中有机物质的降解率，单位为毫克每克（mg/gX——体外发酵24小时后的产气量，单位为毫升每克（mL/g）。A.7微生物的生物合成量的测定A.7.1计算公式试样中微生物的生物合成量以质量(mg)表示，按式（A.3）计算。MBP=[TDOM-（气体t1/2×SF）]……………（A.3）式中:MBP——微生物的生物合成量，单位为毫克（mgTDOM——有机物质的降解率，单位为毫克每克（mg/gSF——化学计量因子，粗饲料的SF是2.20