DB12T 505-2014 玉米转基因成分筛查方法

65.020.01B

04

DB12

天津市质量技术监督局发布DB12/T

505—2014前 言本标准按照

GB/T1.1—2009

本标准由天津市质量技术监督局提出。本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。本标准主要起草人：黄凤军、李建、赵新、陈杰、易萌、朱珠、马强、杨炳存。本标准

2014

年

04

IDB12/T

505—2014玉米转基因成分筛查方法1

范围本标准规定了玉米中转基因成分定性

筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用玉米及其制品中

zSSIIb

内标准基因、CaMV35S

Bt

bar基因、

基因的定性

筛查检测2

规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T

672 转基因植物及其产品检测 农业部

2031

号公告—19—2013

农业部

1485

号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA

提取和纯化3

术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1

基因

gene编码玉米淀粉合酶异构体

Ⅱ-2

3.2CaMV35S

启动子

35S

promoter

from

mosaic

（CaMV）来自花椰菜花叶病毒的

35S

3.3NOS

终止子

of

（NOS）

来自胭脂碱合成酶基因

NOS

的终止子。3.4

基因

（

）来源与苏云金芽胞杆菌（

thuringiensis），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、融合基因。3.5bar

基因

resistance

hygroscopicus，PAT）。该酶具有对除草剂草丁膦（）的耐受性。3.6HPT

基因 HPT

来源于大肠杆菌或链球菌（

），编码潮霉素磷酸转移酶（）的基因。1检测基因引物序列扩增片段长度基因性质zSSIIb

：5′-

：5′-

151

bp内标准基因CaMV35S35S

：35S

：195

bp外源基因NOSNOS

：NOS

：180

bp外源基因BtBt

：5′-

Bt

：5′-

301

bp外源基因barbar

：5′-

bar

：5′-

262

bp外源基因DB12/T

505—20144

检测方法4.1

试剂和材料4.1.1

GB/T

6682

4.1.2

4.1.3

10

g/L

称取

1.0

g

溴化乙锭（EB），溶于

水中，避光保存。注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。4.1.4

10

氢氧化钠溶液：在

160

水中加入

80.0

g

氢氧化钠（NaOH到

200

。4.1.5

500

称取

18.6

g

EDTA-Na加入

70

溶液（4.1.4）调

至

8.0

100

。在

103.4

（121

20

。4.1.6

1

三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（

称取

g

三羟甲基氨基甲烷（）溶解于

800

至

8.0

1

000

103.4

（121

20。4.1.7

TE

8.0）：分别量取

三羟甲基氨基甲烷-4.1.6

2

乙二铵四乙酸二钠溶液（

1

000

。在

103.4

（121

20

。4.1.8

50×

缓冲液：

242.2

g

300

水加热搅拌溶解后，加

100

乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5

至

8.0

1

。使用时用水稀释成

1×。4.1.9

称取

10

12

h

250.0

二甲基苯腈蓝，用

10

水溶解；称取

50.0

g

蔗糖，用

30

水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至

100，在

4

℃下保存。4.1.10

分子量标准：

50

bp～1

000

bp

的

DNA

片段。4.1.11

混合溶液：

10

的

、、dGTP、

四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。4.1.12

Taq

25

氯化镁溶液。4.1.13 引物：玉米内标准基因和转基因玉米外源基因检测时所用的引物序列见表

1。表1

2试剂终浓度体积水——10×PCR

缓冲液1×2.5

µL

hpt

：5′-

hpt

：5′-

472

bp

hpt

：5′-

DB12/T

505—2014外源基因4.1.14

引物溶液：用

缓冲液（）或水分别将上述引物稀释到

10

µ。4.1.15 石蜡油。4.1.16

4.1.17

提取试剂盒。4.2

仪器4.2.1

分析天平：

0.1

g

和

0.1

。4.2.2

升降温速度>1.5

℃<1.0

℃。4.2.3

电泳槽、电泳仪等电泳装置。4.2.4

紫外透射仪。4.2.5

4.2.6

4.2.7

其他相关仪器设备。4.3

4.3.1

抽样按

NY/T

672

和农业部

号公告—19—2013

规定的执行。4.3.2

按

NY/T

672

和农业部

号公告—19—2013

规定的执行。4.3.3

试样预处理按农业部

4—

规定的执行。4.3.4

按农业部

4—

规定的执行。4.3.5

4.3.5.1

反应4.3.5.1.1

反应设置

3

4.3.5.1.2 在

反应管中按表

2

25

µL

表2

PCR检测反应体系3基因名称变性扩增循环次数最终延伸zSSIIb94

℃，5

94

℃，30

s58

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

CaMV35S94

℃，5

94

℃，30

s60

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

NOS94

℃，5

94

℃，30

s60

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

Bt95

℃，5

94

℃，1

56

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

bar95

℃，5

94

℃，30

s63

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

95

℃，5

94

℃，30

s60

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

25

mmol/L氯化镁溶液1.5

mmol/L1.5

µLdNTPs

混合溶液（各

2.5

mmol/L）各

0.2

mmol/L2.0

µL10

µmol/L上游引物0.5

µ0.25～1.25

µL10

µmol/L下游引物0.1～5

µmol/L0.25～1.25

µL

酶0.025

µL——25

DNA模板2

2.0

µL总体积25.0

µL根据

酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到

µL。如果

PCR

缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积水。注

1

PCR

和

0.2µ；CaMV35S

启动子

PCR

检测反应体系中，上下游引物分别是

和

35S-R，引物终浓度分别为0.4µ；NOS终止子PCR和0.4µ；Bt

基因

PCR

和

Bt-R

0.5µ；bar

基因

PCR

检测反应体系中，上、下游引物分别是

和

，引物终浓度分别为

0.2µmol/L；

基因

PCR

检测反应体系中，上下游引物分别是

和

，引物终浓度分别为0.2µmol/L。DB12/T

505—20144.3.5.1.3 将

管放在离心机上，

000

g

离心

10

s，然后取出

管，放入

DB12/T

505—2014中。4.3.5.1.4 进行

反应。反应程序按表

3

表3

PCR反应程序4.3.5.1.5 反应结束后取出

管，对

4DB12/T

505—20144.3.5.2

反应在试样

以非转基因玉米基因组

DNA

CaMV35S、、Bt、bar、

基因的转基因玉米质量分数为

DNA

作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照

反应体系中，除模板外，其余组分及

反应条件与

4.3.6

按

20

1×

琼脂糖溶液中加入

5

µL

EB

溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝

1×

12

µL

产物与

3

µL

加样缓冲液

DNA

2

V/cm条件下电泳检测。4.3.7

凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像系统或紫外透射仪上成像。根据

DNA

分子量标准

扩增片段是否为目的

DNA

片段，按照

和

4.3.9

的规定执行。4.3.8

按

产物回收试剂盒说明书，回收

扩增的

片段。4.3.9

将回收的

产物克隆测序，与玉米内标准基因

zSSIIb、CaMV35S、NOS、Bt、bar、

基因序列（参见附录

A）进行比对，确定

片段是否为目的

DNA

片段。5

结果分析与表述5.1

阳性对照的

反应体系正常。否则表明

反应体系不正常，需要查找原因重新检测。5.2

样品检测结果分析和表述5.2.1 在试样的

反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致；而CaMV35S

NOS

Bt

基因、

基因均未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出转基因成分。结果表述为“试样中未检测出

启动子、NOS

Bt

bar

5.2.2

反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致；启动子、

Bt基因、

基因和

段大小一致，表明试样中检测出转基因成分。结果表述为“试样中检测出

5DB12/T

505—2014附录A（资料性附录）A.1

基因扩增产物核苷酸序列1

CTCCCAATCC

TTTGACATCT

GCTCCGAAGC

AAAGTCAGAG

CGCTGCAATG

CAAAACGGAA61

CGAGTGGGGG

CAGCAGCGCG

CGGACCCAAA

GCTGATCATC121

CATCAGCTCC

TGTCACCAAG

AGAGAAATCG

A注A.2

CaMV35S启动子扩增产物核苷酸序列1

GCTCCTACAA

ATGCCATCAT

TGCGATAAAG

GAAAGGCTAT

CATTCAAGAT

GCCTCTGCCG61

ACAGTGGTCC

CAAAGATGGA

CGTGGAAAAA

GAAGACGTTC121

CAACCACGTC

TTCAAAGCAA

GTGGATTGAT

CACTGACGTA

AGGGATGACG181

CACAATCCCA

注A.3

终止子扩增产物核苷酸序列1

GAATCCTGTT

GCCGGTCTTG

CGATGATTAT

CATATAATTT

CTGTTGAATT

ACGTTAAGCA61 TGTAATAATT

AACATGTAAT

TGGGTTTTTA

TGATTAGAGT121 CCCGCAATTA

TACATTTAAT

ACGCGATAGA

TAGCGCGCAA

ACTAGGATAA注：划线部分为引物序列注：划线部分为引物序列A.4

基因扩增产物核苷酸序列1

GAAGGTTTGA

GCAATCTCTA

CCAAATCTAT

GCAGAGAGCT

TCAGAGAGTG

GGAAGCCGAT61

CCTACTAACC

CAGCTCTCCG

TCAACGACAT

GAACAGCGCC121

TTGACCACAG

CTATCCCATT

GTTCGCAGTC

AAGTTCCTCT

CTTGTCCGTG181

TACGTTCAAG

CAGCTAATCT

TCACCTCAGC

ACGTTAGCGT

GTTTGGGCAA241

AGGTGGGGAT

TCGATGCTGC

AACCATCAAT

ACGACCTTAC

TAGGCTGATC301

G注A.5

bar基因扩增产物核苷酸序列1

GAAGGCACGC

AACGCCTACG

ACTGGACGGC

CGAGTCGACC

GTGTACGTCT

CCCCCCGCCA61 CCAGCGGACG

GGACTGGGCT

CTGAAGTCCC

TGGAGGCACA121 GGGCTTCAAG

AGCGTGGTCG

CTGTCATCGG

GACCCGAGCG

TGCGCATGCA181 CGAGGCGCTC

GGATATGCCC

CCCGCGGCAT

GCCGGCTTCA

AGCACGGGAA241

CTGGCATGAC

GTGGGTTTCT

GG6DB12/T

505—2014注A.6

HPT基因扩增产物核苷酸序列1

GAAGTGCTTG

ACATTGGGGA

GTTTAGCGAG

AGCCTGACCT

ATTGCATCTC

CCGCCGTGCA61

CAGGGTGTCA

CGTTGCAAGA

CCGCTGTTCT

ACAACCGGTC121

GCGGAGGCTA

TGGATGCGAT

CGCTGCGGCC

AGACGAGCGG

GTTCGGCCCA181

TT