DNA样品制备方法 沉淀法

2T/SHAIAXXXX—XXXX甲基化分析中的DNA样品制备方法沉淀法本标准规定了组织和培养的细胞等生物样本中DNA甲基化分析的样品制备方法。本标准适用于从组织和培养的细胞中提取DNA用于甲基化分析。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。国家标准或国际标准3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA甲基化（DNAmethylation）是基因表达调控的一种重要机制，是在不改变DNA序列的前提下对基因组DNA进行甲基化修饰。4原理DNA甲基化检测可以采用的方法比较多，PCR法是比较是比较简单易行的方法之一。原理是利用亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶在转化过程中保持不变。转化后，DNA的甲基化情况可以通过PCR扩增或DNA测序来判定。在PCR法检测中DNA的纯化最常用的的方法是沉淀法。除上述比较经典的沉淀法以还有有物理的方法：如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式如酶法，根据核酸分离纯化方式的不同有硅质材料、阴离子交换树脂等。沉淀法是在去污剂的作用下将细胞裂解，然后在细胞裂解也中加入SDS加速细胞破碎，再加入酒精将DNA沉淀，采用蛋白酶K和氯仿/异戊醇去除蛋白质，得到纯化的DNA。5仪器设备5.1高速台式离心机，5.2高速冷冻离心机，5.3紫外可见分光光度计，5.4紫外及化学发光凝胶成像仪。5.5超纯水系统6试剂和材料6.2.纯净水ddH2O，电阻率>18Ω（分子生物学级）3T/SHAIAXXXX—XXXX）（），6.4.苯酚（分子生物学级6.5氯仿（分子生物学级）。7样品7.1样品来源：甲基化检测的样品可以来源于血液、冷冻组织样本或石蜡组织块。用于甲基化分析的样品应采用冷冻和其他适当的方法保存良好以防样品降解。7.2样品处理：采用细胞裂解液或其他适当的试剂提取细胞和组织中的DNA，进一步将DNA与蛋白质和其他杂质等分离并采用苯酚-氯仿或其他适当的方法如沉淀法等纯化DNA，纯化后的DNA经95%或100%酒精再次冲洗沉淀，获得的DNA沉淀采用纯净水再次溶解备用。8DNA样品制备试剂配制9DNA样品分析DNA纯度检测一半采用分光光度法在波长260nm对其进行检测，同时可以通过测定DNA样品在260/280（A260/A280）的紫外吸收值估算DNA的纯度，其比值在1.8为纯度较好，其比值高于2.0预示着样品中有RNA没有除尽。同时也可以采用凝胶电泳的方法检测DNA的纯度，并检测样品中是否有RNA存在。4T/SHAIAXXXX—XXXXXXXXXXXXX核酸提取方法主要包括以下几种：1、沉淀法。通过采用细胞裂解液破坏细胞结构来释放核酸，采用化学试剂将细胞中的DNA提取出的方法。2、化学试剂法。利用核酸和杂质在水和有机溶剂中的溶解度差异进行分离提纯。该方法使用异硫氰酸胍和乙醇/异丙醇来沉淀水相中的核酸。3、柱纯化法。利用二氧化硅材料吸附原理，在高盐浓度下，通过带正电荷的二氧化硅柱膜和带负电荷的核酸之间的亲和力，使核酸被富集于二氧化硅基质，其他杂质被清除。4、磁珠法。利用磁珠与核酸的特异性结合，通过磁场作用进行分离。此外，还有吸附材料结合法，如硅质材料、阴离子交换树脂和磁珠，这些方法利用核酸与吸附材料之间的特异性结合进行分离。每种方法都有其特定的应用和优势，选择哪种方法取决于实验的具体需求和条件。沉淀法提取DNA：从组织或培养的细胞中分离DNA1.将组织切成小块，培养的细胞直接进行下一步。），最终浓度20ug/ml，在37℃下孵育1小时。3.加入蛋白酶K至最终浓度100ug/ml，充分混合，在50℃下孵育3小时或过夜。4.在室温下冷却溶液，加入等体积的苯酚（pH8.0），通过缓慢地将管端翻转10分钟或将管放置在滚筒设备上混匀1小时，将两相轻轻混合。5.将试管在10000g下离心15分钟。6.将水相（上层）转移到新试管中。7.在室温下加入0.2倍体积的10mol乙酸铵（NH4Ac）和2倍体积的100%乙醇，轻轻混合。如果使用NaAc（pH5.2），则添加0.1