TCI 390-2024 健康人（异体）免疫细胞（CIK）的制备技术和应用规程

TICS11.100TCCSC27团 体 标 准T/CI390—2024健康人（异体）免疫细胞（CIK）的制备技术和应用规程Thetechnicalregulationforpreparationandclinicalapplicationofimmuno-cellCIKfromhealthyperson2024-06-24发布 2024-06-24实施中国国际科技促进会发布T/CI390－T/CI390－2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANIII目 次目 次 I前 言 II引言 Ⅲ健康人（异体）免疫细胞（CIK）的制备技术和应用规程 1范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1仪器设备条件和细胞培养器材 2溶液配制和细胞培养技术 3CIK细胞制备规程 4质量检测和标准 5检验与放行 6标注运输与追踪 6CIK细胞临床治疗方案和疗效评价 6附录 9参考文献 11前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由澳科大生命科技集团有限公司提出。本文件由中国国际科技促进会归口。本文件主要起草人员：祁岩超、张卫东、祁秋干、纪娜、王远东、史强、杨高远、段红伟、周晶、陈梦梦、张炳强。本文件是首次发布。引 言本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：广州市坤圣生物科技有限公司27703电话箱：ycqi@163.net请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。T/CI390T/CI390—2024PAGEPAGE10健康人（异体）免疫细胞（CIK）的制备技术和应用规程范围CIK规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用（包括所有的修改单）适用于本文件。YY0572-2015《血液透析及相关治疗用水》YY0598-2006《血液透析及相关治疗用浓缩物》T/CGCPU019—2022《免疫细胞产品供者材料管理要求》术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1免疫细胞产品immunecellproducts经过体外分离、培养、扩增后制成的人源活免疫细胞3.2供者donor用于免疫细胞产品（3.1）采集、制备的细胞的来源是人3.3供者材料suppliermaterials从供者外周血，脐带血获得的用于免疫细胞产品生产的免疫细胞。3.4生物安全biosafety细胞的采集和制备处于没有危险和不受生物因子及相关因素威胁的状态.仪器设备条件和细胞培养器材仪器设备条件场地条件：GMP（）10-30M，）501002，（32005002大型设备：血细胞分离机（单采机）流式细胞仪酶标分析仪内毒素检测仪常速，超速离心机常温，低温冰箱（柜）图像仪器，倒置显微镜细胞培养器材清洗与消毒玻璃器皿的清洗清水浸泡——洗衣粉刷洗——自来水冲洗——晾干，浸酸过夜——自来水冲洗10次以上——蒸馏水洗2-3次——烘干，包装——灭菌，贮存备用。培养板和培养瓶用符合国家标准规定的商售一次性使用培养瓶，袋物品。载玻片用一次性使用的物品。胶塞的清洗。自来水浸泡——2NAOH10~201HCL302~3灭菌使用前，先检查高压灭菌器主体内水位是否超过电热管。在加热开始时，放气阀垂直，使空气随加热由桶内逸出。待有较急的蒸汽喷出时，即将放气阀拨回水平位置。4.3.3瓶皿121-12615MIN;器械121-12610MIN;橡胶12115MIN;溶液121-12620-40MIN124-126124℃时，则应在蒸汽压力到达所需范围时，适当调节开关使之维持恒压。01-210-153/4细胞培养操作技术洗液的配制重铬酸钾先溶于水中，然后，将浓硫酸缓慢加入。[强液]重铬酸钾63G，浓硫酸1000ML，蒸馏水200ML「常用」重铬酸钾63G溶于800ML蒸馏水,再缓慢加入浓硫酸1000ML.「本室」重铬酸钾120G：浓硫酸200ML：蒸馏水1000ML细胞培养液商售一次性应用的完全培养液：16405.2.2配置：1640干粉15-30℃（室温）三蒸水中，缓慢搅拌令之溶解，并将袋中微量粉末冲下。NAHCO32.0G/L16403.7G/LDMEM1L。1NHCL1NNAOHPHPH*7.2—7.3。（PH0.22UM4℃条件下保存，备用消化液的配制（0.25胰蛋白酶）PH7.2PBS0.25G4(3).除菌过滤，分装入瓶，-20℃冰箱保存。BSSPBS/升）准确称量试剂。(含有水份的水化物，与不含水份者的称量不同，应加以换算)。KCL0.2，KH2PO40.2，NACL8.0，NA2HPO4·7H2O.56。750ML1000ML10MIN，分装瓶中，4℃保存。细胞培养操作程序细胞计数法1ML0.25%胰蛋白酶液，37℃温箱中消化，至细胞5.0ML，轻轻吹打制备成细胞悬液。190.412-3MIN。1-2100595%。/悬液=4/）*14*毫升数.10-16细胞/ML范围.细胞传代将瓶中的培养液倒出，镜检，离心重悬细胞，用吸管将瓶壁上的细胞吹打均匀。8-10ML，置培养箱中培养。悬浮细胞传代时，只需吸出少量细胞转入新瓶，并补足营养液即可。CIK制备程序包被培养瓶50ML10MLD-PBS。每管加入专用试剂若干，CD3AB50ΜL75CM24℃冰箱内，避光过夜。PBMC单采机采取分离出相应数量单个核细胞。50ML50ML20%（5ML））30-60（1/2）将两管中的上层（血浆+淋巴细胞）移入新的离心管，350G/10MIN(5800G/20MIN（即自体血浆）留用。(610MLFICOLL50ML20MLD-PBSFICOLL380G/20MIN8)吸取PBMCD-PBS40ML350G/8MIN40ML300G/8MIND-PBS3×107(106/ML)/30ML/瓶,IL-230ΜL（1000U/ΜL），IFN-Γ15ΜL(1000U/ML1.5ML(即血浆浓度为5%)。显微观察，置于5%CO2，37℃培养,2细胞转移至培养袋450ML5—10ML（此时细胞一般不用酶来消化，以免损伤细胞）。计数细胞，检测细胞活度，杀伤活性，流式细胞仪测定等。IL-2100ΜL6ML，（IL-2500U/ML3%，细胞浓度一般不可低0.4×105/ML）。每天显微观察细胞状态。IL-2,500U/ML18（0.31000ML20%白蛋白15ML）。回收细胞在培养袋三次加液后（12）1200-1800ML(初转150200ML50MLD-PBS2质量检测和标准显微观察细胞状态，取样计数肉眼观察，培养袋或培养瓶中培养液清澈，无混浊。细胞活度：90%以上为合格。杀伤活性：CIKK56220:180%以上为合格。CIKCD3CD5620%或以上为合格。CD3CD4/CD850CIK安全检测：热源，病毒,支原体，细菌（霉菌）检测合格。热源检测-定性检测法：取CIK细胞培养上清液用鲎试剂凝胶法检测：结果阴性（-）为合格。热源检测-定量检测法：检测流程仪器及软件准备：试验前开启动态试管检测仪，温度在37OC.0.4ML1MIN,得到样品阳性对照液。0.1ML0.9ML(30.25ML1MIN0.05ML0.1ML0.05ML0.1ML0.05ML0.1ML结果分析：试验有效性条件：阴性对照项检测值应小于标准曲线最低点的检测值。(250－200%之间。50－200%之间。0.5EU/MLHIV、HBV、HCV、TP方法按检测试剂盒说明书进行。检验与放行细胞制品达到：（1）无微生物，无内毒素；（2）细胞活性>90%；（3）细胞表型达到本标准的要求；有专职的质量控制员和技术长联合签名发放。标注，运输与追踪发放的细胞产品留样（5ML）3外发的细胞制品：有细胞名称，数量，外观项目，发放人签名标注。按规定进行一次性密封，密封口有签名的一次性密封条加封。放置带有温度记录的血液保存-输送箱中，外加封条。（4）24小时内签收。追踪制备方必须向应用方进行常规进行细胞治疗追踪和记录。CIK临床治疗方案病例选择.病例排除标准：（1）有严重过敏体质的病人。（2）严重心，肝，肾功能衰竭的病人。（3）临床医生认为不适应的病人。治疗方案参照2021年2月国家药品监督管理局药品评审中心公布的《细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》中的“剂量探索和剂量递增”原则，每例患者至少二个疗程；每疗程输注6次，CIK150-300X1085MG，于CIK30-50×108150-200ML602-3肝动脉灌注：10-20×10850-60ML3不良反应及其处理本研究采用的健康人CIK细胞是异体免疫细胞，因专利技术处理，治疗相当安全。有部分病人（3-5%）2-10（38.50C）2-6390C临床疗效评价一般临床症状治疗前后变化：包括：精神状况、睡眠情况、体重、食欲、痛疼等（详见观察表格）实验室检查指标：癌标记物原发性肝癌 治疗前后查 AFP，CA19-9非小细胞肺癌 治疗前后查 CEA和CA125等结直肠癌 治疗前后查 CEACA724等具体各种癌症病人治疗前后均查AFP、CEA、CA125、CEA。收集资料可综合分析不同癌标记物在不同肿瘤中的临床意义。.患者自身外周血淋巴细胞亚群测定1MLT,B（见附表）患者自身免疫能力（NK）测定10MLK562NK临床影像学指标1979WHO(COMPLETEREMISSION,CR)4(PARTIALREMISSONPR)：双径可测病灶，各病504504(STABLEDISEASE50254(PROGRESSIVEDISEASEPD):一个或多个病灶增大超过25包括：CT、BPET4部分缓解（PR）肿瘤最大横径与最大垂直径的乘积减少50%以上，并维持4周以上好转（MP）2550%4进展（PD）肿瘤病灶乘积增大25%以上，并有新病灶出现。有效率（%）=（CR+PR）例数/治疗总例数×100%存活时间病人的带瘤生存和无瘤生存时间应是疗效评估的重要指标。1、2、3、5CIK治疗组：用CIK生物治疗5个疗程以上的病例。对照组：和临床应用单位同时期内，只用三大常规疗法，不用CIK生物治疗的同种病例相比较。附录一CIK（NK）活性检测表制备效靶细胞时 分（ ）抽静脉血 ML， 时 分得PBMC 个（ /ML）。取PBMCML（ /ML）加稀释液ML，调浓度为/ML，共ML取K562ML（ /ML）加稀释液ML，调浓度为/ML。共ML2.实验分组（每组三个平行孔）实验组： 效应细胞 ΜL+靶细胞ΜL/孔（E：T=:)靶细胞组：靶细胞ΜL+1640液ΜL/孔效细胞组：效细胞ΜL+1640液ΜL/孔2.孵育 月 日时 分（）放入37℃CO2培养箱。4.加MTT 月 日时 分（）加MTT10ΜL/孔。5.酸性异丙醇 月日 时分（ ）加酸性异丙醇100ΜL/孔。MK3（650NM）OD结果：CIK活性=靶细胞组OD值－（实验组OD值－效应细胞组OD值）/ 靶细胞组OD值×100%检验者 核对者年 月 日二细胞质量检测登记表细胞类型：CIK 供者姓名： 性别： 年龄： 资料编号：日期项目结果检验者核对者正常参考值细胞活度大于85%杀伤活性80%-88%流式检测CD3CD56大于20%HIV阴性HBV阴性HC