巢式PCR的文档资料

巢式PCR1.增效PCR（boosterPCR）当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。2.巢式PCR此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增巢式RT-PCR,这种方法的特点是需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模版3.RT-PCRRT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。4.基因芯片（又称DNA芯片，生物芯片，DNA探针微列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实双链DNA合成后，利用核酸酶S1切去回折处单链DNA，但会使cDNA失去5‘端部分序列。现在较少用RNaseH部分水解杂交链中的RNA链，但留下一些小片段RNA，作为合成cDNA第二链的引物。还需要加入DNA连接酶连接合成片段末端转移酶在cDNA第一链3’端添加一种寡聚寡聚核苷酸尾巴，然后以配对的寡聚物作为引物合成第二链6.DNA测序： DNA的序列分析的两种基本方法：化学法 Maxam-Gilbert酶法 Sanger，双脱氧终止法 现在全自动测序仍然沿用Sanger氏酶法，但是在标记上作了改进双脱氧终止法： 双脱氧核苷酸(ddNTP)的脱氧核糖的3‘位置的-OH缺失。 当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与DNA合成，以其5'位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的3'位置的-OH结合，但是，由于它自身3'位置-OH的缺失，至使下位核苷酸的5'磷酸基无法与之结合过程：设计4种反应体系：都含有正常的4种dNTP（其中一种用同位素标记）单链DNA模板（即待测DNA）引物和DNA聚合酶I每组分别各加入一种ddNTP如果是dNTP掺入其中，DNA互补链则将继续延伸下去；如果是ddNTP掺入其中，DNA互补链的合成则到此终止。由于双脱氧核苷酸的掺入是随机的，故各个新生DNA片段的长度互不相同通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（能分辨出小至一个碱基长度差的DNA片段），将混合产物中不同长度DNA片段分离开，再通过放射自显影，根据片段尾部的双脱氧核苷酸读出该DNA的碱基排列顺序DNA自动测序：基于Sanger双脱氧链终止法的原理，只不过用四种不同的荧光染料分别标记ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。这四种荧光染料在激