动物遗传学：果蝇的三点测交试验

果蝇的三点测交试验基因定位基因在染色体上有一定的位置。确定基因在染色体上的位置就叫做基因定位（genemapping）。

1、基因位于哪一条染色体上

2、基因在染色体上的位置

3、与相邻基因之间的关系确定基因的位置主要是确定基因之间的相对顺序和距离。基因之间的距离是用重组率来表示的。两点测验

三点测验genemapping基因定位Ageneismappedonaspecificchromosome基因定位于某一特异性染色体上

Theorderanddistanceofgenesonachromosomearedetermined基因在染色体上线性排列的顺序与距离（一）、交换率与基因定位交换率又称重组率：指重组型配子占总配子数的百分率。基因在染色体上的距离与基因间的交换率成正比，基因在染色体上的位置可以用交换率来表示（去掉百分号）。相关概念基因定位：把已发现的某一突变基因用各种不

同的方法确定在生物体某一染色体

的一定位置上。连锁图：表示各个染色体上的一系列相互连锁

的基因的排列次序及其相对距离的示

意图。Methodsforgenemapping

基因定位方法Geneticrecombination遗传重组值定位Pedigreeanalysis家系分析定位Aneuploidymapping利用非整倍体定位Cytogeneticmapping细胞学定位Somatichybridization体细胞杂交定位Genetransferringmapping基因转移定位Physicalmapping物理学定位Geneticrecombination

遗传重组值定位

基本原理：成对的染色体在减数分裂过程中发生交换，交换的结果使染色体上的基因发生重组。两个基因之间发生重组的频率取决于它们之间的相对距离，因而可以重组率（即互换率）来表示它们之间的相对距离Pedigreestudies家系分析定位Sex-linkage性连锁Gene-chromosomelinkage基因-染色体连锁Gene-genelinkage基因-基因连锁杂种蛋白质氨基酸顺序分析定位Linkagedisequilibriumanalysis连锁不平衡的分析定位Aneuploidymapping

利用非整倍体定位经典的非整倍体分析定位：通过计数非整倍体与正常个体杂交后的后代分离比来定位基因以酶作标记，测定非整倍体杂合子后代中的等位剂量，从而定位酶基因Cytologicalmapping细胞学定位在细胞水平上观察染色体异常而将基因定位于这一染色体的异常区一般用于对果蝇和哺乳动物的基因定位方法有缺陷定位，病毒影响定位和基因剂量定位Somatichybridization

体细胞杂交定位

利用亲缘关系较远的动物或植物细胞融合后会出现染色体丢失的现象而实现将基因定位于某一染色体上Syntenytesting同线性测验Selectingmapping选择定位Translocationanalysis易位定位Deletionanalysis缺失定位Proteinanalysis蛋白质分析定位Dotblotting点杂交定位SouthernBlotting

定位Physicalmapping物理学定位Denaturedmapping变性定位TranscriptionalR-loopmapping转录R-环定位Heteroduplexedmapping异源双链定位Insertionandinactivation插入失活定位insituhybridization原位杂交PartialmapofthechromosomesofDrosophilamelanogaster.（二）、基因连锁群的测定生物的每条染色体上聚集着成群的基因。位于同一对同源染色体上的基因即称为一个基因连锁群。人的23对染色体－23个连锁群From《HumanGenetics-Conceptsandapplications》P243，Chapter12Chromosomes1、测定基因所属连锁群的方法⑴、性连锁法哺乳动物中如果某一性状只出现在雄性动物中，则可以肯定控制该性状的基因必在Y染色体上；表现明显的伴性遗传的性状，其基因可定位在X染色体上。⑵、标记染色体连锁法通过分析阐明标记染色体与某一基因的连锁关系将基因定位于该染色体。例：人的Daffy血型基因与人的1号染色体长臂靠近着丝粒的区域变长之间有连锁关系。家系分析表明，该染色体结构的这种变化是遗传的。因此，可将Daffy基因定位于1号染色体。⑶、细胞学基因定位法当异常染色体的发生与某一基因的异常表达呈平行关系时，即可确定该基因与该染色体间的连锁关系。⑷、体细胞杂交定位法体细胞杂交：在人工条件下，亲缘关系较远的两类动植物的细胞可以发生融合，融合后的细胞往往会专一地丢失某一亲本的染色体，而丢失的基因往往是随机的。因此，可用于定位人和其他哺乳动物的基因。

例：人、鼠杂种细胞常常丢失人的染色体。利用核酸分子探针（特定基因）与人－鼠杂种细胞进行杂交，含有相应染色体的细胞将呈阳性结果，从而可将该基因定位于某一染色体上。例：人的β-球蛋白DNA探针只与含有人的11号染色体的杂种细胞杂交呈阳性，因此可以判定β-球蛋白基因定位于11号染色体上。2、基因在染色体上位置的测定根据重组率的定位方法，可分为两点测交和三点测交两种。⑴两点测交利用杂交所产生的F1与双隐性个体进行测交，计算两对基因的相对距离。让这两对基因分别与第三对基因分别进行三次两点测交得到这两对基因在染色体上的顺序。⑴两点测交测定次数多，工作量大。每一次两点测交的结果都受特定环境条件的影响，从而使整个实验的测定结果存在不可避免的误差。缺点

（一）两点测验两点测验是基因定位的最基本的方法，它是通过一次杂交和一次测交来确定两对基因是否连锁以及它们之间的距离。仅凭一次两点测验结果，不能确定两对基因在染色体上的顺序（即方向）。假如要确定三对基因的位置，要做三个两点测验才能完成。设有A-a、B-b和C-c三对基因，其定位的具体步骤是：

1、通过一次杂交和一次测交，求出A-a和B-b之间的重组值，根据重组值确定它们是否连锁。

2、再通过一次杂交和一次测交，求出B-b和C-c之间的重组率，并根据重组率来确定它们是否连锁。

3、又通过同样的方法确定A-a和C-c是否连锁。

4、根据三个重组值的大小，确定这三对基因在染色体上的位置。

例：玉米籽粒颜色C-c(有色-无)，饱满（Sh）对凹陷（sh）为显性，非糯性（Wx）对糯性（wx）为显性，为了明确这三对基因是否连锁，曾有人做过三个两点测验。

1有色饱满×无色凹陷

CCShSh

ccshsh

有色饱满无色凹陷

CcShsh×ccshsh3.6%

2饱满糯性x凹陷非糯

wxwxShSh

WxWxshsh

WxwxShsh×wxwxshsh20%

3非糯有色x糯性无色

WxWxCC

wxwxcc

WxwxCc×wxwxcc23.6%

结果：1C-c和Sh-sh之间的重组值为3.6%

2Wx-wx和Sh-sh20%3Wx-wx和C-c23.6%

这样，可以确定三个基因之间的顺序和距离如下图：

203.6

wx―――――――――Sh―――C

两点测验法有两大缺点：

（1）工作量大。要给三个基因定位须做三次杂交和三次测交。

（2）如果基因间距离较远，很可能发生双交换，而影响测定结果的精确性。（二）三点测验三点测验是基因定位最常用的方法。通过一次杂交和一次测交，能同时确定三个非等位基因间的排列顺序和遗传距离，而且结果也比较精确。

仍以上述玉米的三对等位基因为例，介绍三点测验的具体步骤。

步骤：1杂交

2测交

凹陷非糯性有色×饱满糯性无色

shsh++++↓++wxwxcc

+Sh+Wx+c×shshwxwxcc

一、实验原理和目的本实验通过对同一染色体上的三个非等位基因的交换行为来验证基因是在染色体上呈直线排列的。先将野生型果蝇与三隐性果蝇杂交，作为三因子杂种(abc／+++)，再用三隐性个体进行测交。在测交后代中，因交换可得到各种类型的组合。与两个亲本表型不同的称为重组合类型。用两个基因座位间重组值的大小表示基因间的相对距离。一、实验原理和目的

三隐性个体的表型是小翅(miniature)，白眼(white)，焦刚毛(singed)，由位于X染色体上的三个隐性基因m，w和sn3决定。野生型个体是长翅、红眼和直刚毛，决定这些性状的相应基因表示为+++。将三隐性个体与野生型杂交，取F1代雌蝇（三杂合子），用三隐性个体测交，得测交后代。

注意：本实验采用三隐性雌蝇与野生型雄蝇杂

交，F1代雄蝇为三隐性个体，因此可直接用于测交。三点测交试验中得到测交后代的交配程序

二、实验准备

1、用具：双筒解剖镜或显微镜，麻醉瓶，瓷板，海绵板，毛笔，镊子，毛边纸，盛有饲料的牛奶瓶1个，指管2个。2、药品：乙醚，酒精。三、实验步骤

用三隐性个体(小翅，白眼，焦刚毛)和野生型作实验材料。以三隐性为母本，在实验前收集处女蝇，培养于指管中。把野生型雄蝇挑出，放到盛有处女蝇的指管中进行杂交。贴好标签后，在22~23℃中培养。7~8天后，倒去亲本。再4~5天后，子一代成蝇出现，进行观察。F1雌蝇全部是野生型，雄蝇全部是三隐性。从F1代中选6~7对果蝇，放到指管中，在23℃下培养。

这里雌蝇不一定要是处女蝇（为什么？）

若用反交F1雌蝇一定要选处女蝇（为什么？）

三、实验步骤

7~8天后倒去亲本。再过4~5天，F2代成蝇出现。开始观测。

果蝇倒出麻醉，放在白瓷板上，用解剖镜检查眼色、翅形、刚毛，各类果蝇分别计数。统计过的果蝇倒掉。

过2天后再检查第二批。最多可连续检查7~8天，即3~4次。再迟F3代就出现了。

要求至少统计250只果蝇。因为群体越大，重组值越精确。也可以将几个组的数字相加，用来计算重组值。四、实验结果统计分析

l、将结果填表、计算：

先写出应有的8种表型。填上观察数、计算总数。样表四、实验结果统计分析

2、填写“基因是否重组一栏”：

样表四、实验结果统计分析

3、计算基因间的重组值：

样表

如何分析上述结果呢？

第一步：判断这三对基因是否连锁。若这三对基因不连锁，即独立遗传（分别位于非同源的三对染色体上），测交后代的八种表现型应该彼此相等，而现在的比例相差很远。

其次，若是两对基因位于同一对同源染色体上，另一对独立，应该每四种表现型的比例一样，总共有两类比例值。现在的结果也不是如此。试验结果是每两种表现型的比例一样，共有四类不同的比例值，这正是三对基因连锁在同一对同源染色体上的特征。

第二步：确定排列顺序

既然这三对基因是连锁的，在染色体上就有一个排列顺序的问题。首先在Ft群体中找出两种亲本表现型和两种双交换表现型。双交换的可能性肯定是最少的，而亲本型个体数应该最多。四、实验结果统计分析

4、画遗传学图：

？？？四、实验结果统计分析5、计算并发率和干涉：

如果两个基因间的单交换并不影响邻近两个基因的单交换。那么预期的双交换频率应等于两个单交换频率的乘积。但实际上观察到的双交换频率往往低于预期值。因为每发生一次单交换，它邻近也发生一次交换的机会就减少一些，这叫做干涉。一般用并发率来表示干涉的大小。

□三点测验法

·通过一次杂交和一次测交就可得出三个基因的距离和顺序

·♀黄体白眼短翅（ywm/ywm）×♂灰体红眼长翅（＋＋＋/＋＋＋）

F1♀灰体红眼长翅（＋＋＋/ywm）×♂黄体白眼短翅（ywm/ywm）

测交后代有有8种表型，其中2种亲本型，4种单交换（两种类型），2中双交换。亲本型数量最多，双交换最少。

表型基因型交换类型观察数所占%灰体红眼长翅＋＋＋/ywm亲本组合157463.96黄体白眼短翅ywm/ywm1382灰体白眼短翅＋wm/ywm单交换1271.26黄体红眼长翅y＋＋/ywm39灰体红眼短翅＋＋m/ywm单交换276834.39黄体白眼长翅yw＋/ywm826灰体白眼长翅＋w＋/ywm双交换100.39黄体红眼短翅y＋m/ywm8表5-8的说明—测交后代的表型和数目

双交换率＝双交换类型在后代中占的比例＝0.39%y与w的交换率＝单交换1占的比例＋双交换率＝1.26%＋0.39%＝1.65%w与m的交换率