《血红蛋白的提取和分离》复习课件

课题3血红蛋白的提取和分离1.通过进行探究实验，结合观看实验视频，能够尝试从血液中提取和分离血红蛋白2.通过阅读资料，结合教师讲解，能够了解色谱法、电泳法等分离生物大分子基本原理1.透析法分离蛋白质的目的是除去小分子

杂质。

2．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对

分子质量大的先洗脱出来，相对分子

质量小的后洗脱出来。3．在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。4．SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子的大小。5．蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、纯化和纯度鉴定。蛋白质特性的差异①分子的

②所带的

性质和多少③溶解度④吸附性质⑤对其他分子的

形状和大小电荷亲和力1．蛋白质分离的理论依据蛋白质分离的原理和方法2．分离的方法(1)凝胶色谱法：根据

分离蛋白质的一种有效方法，也称做

法。

(2)电泳：①概念：指

在电场的作用下发生

的过程。②原理：在一定的

下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上

，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷

的电极移动。相对分子质量的大小分配色谱带电粒子迁移pH正电或负电相反③影响电泳效果的因素：带电性质大小形状迁移速度④方法：常用的电泳方法有

电泳和

电泳。琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶3．缓冲溶液(1)配制：由1～2种

溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的

就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。(2)作用：在一定范围内，抑制外界的

对溶液pH的影响，维持pH基本不变。缓冲剂使用比例酸和碱1．凝胶色谱法(1)凝胶：是一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道，具有多孔的凝胶，又称为分子筛。(2)原理：相对分子质量大相对分子质量小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被排阻在外面小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部运动方式垂直向下移动无规则扩散进入凝胶颗粒运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来2．电泳的常用方法(1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：①凝胶形成：单体(丙烯酰胺)＋交联剂(N，N′­亚甲基双丙烯酰胺)引发剂和催化剂三维网状结构凝胶②加入SDS的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，与各种蛋白质形成蛋白质­SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。[特别提醒]

测定蛋白质相对分子质量通常用SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳，原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定性强，可用检测仪直接测定。杂蛋白1．样品处理(1)红细胞的洗涤：①目的：去除

，以利于后续步骤的分离纯化。②措施：分离(低速短时间离心)→用胶头吸管吸去上层透明黄色血浆→下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤(如此重复三次)。实验操作(2)血红蛋白的释放：①目的：使红细胞破裂释放

。②过程：血红蛋白甲苯（3）分离血红蛋白溶液①将混合液

②将试管中的液体用

过滤③除去

④于

中静置片刻⑤分离出下层的红色透明液体离心滤纸脂溶性沉淀层分液漏斗2．粗分离——透析(1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12h。(2)目的：将

的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使

自由进出，而将

保留在袋内。小分子大分子物质相对分子质量较小3．纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。(1)凝胶色谱柱的制作：①取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②柱底制作：打孔→挖凹穴→安装

→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。③柱顶制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。移液管头部(2)凝胶色谱柱的装填：①色谱柱固定于支架上。②干凝胶的计算和称量。③溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成

。④装填：打开

，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。⑤洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用20mmol/L的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12h。凝胶悬浮液下端出口(3)样品的加入和洗脱：①调整缓冲液面：与

平齐

②滴加透析样品：用量为1mL

③样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层

④洗脱：打开下端出口，用

洗脱

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱

时，用试管收集流出液，每试管5mL，连续收集凝胶面磷酸缓冲液底端1．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。2．血红蛋白释放过程加入蒸馏水和甲苯目的是什么？提示：加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂以释放血红蛋白。

3．血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

实验结果分析与评价1．对血液样品处理后样品发生的变化(1)正常现象：血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。(2)分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。(3)红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。2．判断装填的凝胶色谱柱成功与否（1）方法在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯检查凝胶是否装填均匀加入大分子的有色物质，观察色带移动情况（2）成功的标准其调整若色带均匀、狭窄、平整，说明性能良好若色谱柱内出现纹路或气泡，可轻轻敲打柱体以消除气泡，若消除不了则重新装柱3．对分离效果的判断(1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。(2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。[特别提醒]

洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一，如果样品出现浑浊、有沉淀，可离心或过滤后再加样，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。[例1]下图表示对某蛋白质溶液进行SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(相似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是(

)A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动B．蛋白质在SDS­聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少

C．蛋白质在SDS­聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于相对分子质量的大小D．电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种[解析]蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。[答案]

B蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋白质分子的大小相关；在电场中的运动速度和方向除了与蛋白质的分子大小相关外，蛋白质的带电性质、电量、形状都影响其在电场中的运动方向和运动速度。[例2]凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是__________，原因是__________。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由________________________替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_________________________________。(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体________(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________________________。(5)若选用SephadexG­75，则“G”表示________，75表示________。[解析]

本题主要考查凝胶色谱法的原理和操作注意事项，可按以下思路进行分析作答。

(1)原理：由于不同蛋白质其相对分子质量不同，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。(2)注意事项：