核磁共振波谱学讲义第三章-NMR实验技术基础(4脉冲技术)

第三章NMR实验技术基础4脉冲技术a频偏效应(off-resonanceeffects) 由于射频场为单色波，而样品中的化学位移有一定的范围，因此不同的核感受到的有效场也不同。(1)脉冲作用对象为Z磁化向量 在off-resonance状态，相位y的脉冲作用于平衡态的z磁化向量后： 当频偏大时有明显的相位及强度的畸变： 这个式子适合于分析相位与频偏的关系。 当频偏不大于射频场频率时，90度脉冲后的水平分量的相位与频偏基本上是线性关系， 因此不太大的频偏下，实际的90度脉冲可以当成理想的90度脉冲，后跟一段演化期，时间长度为 相比之下，有频偏时180度脉冲的效果要差的多，通常需要其他技术来弥补。 90度脉冲的激发曲线的第一个零点位于 180度脉冲的激发曲线的第一个零点位于 如蛋白质中C的化学位移平均在56ppm左右,而CO的化学位移在174ppm左右，若要激发其中之一同时对另一个影响最小，180度方波的功率应选择为,对应的脉冲宽度大约58.4s.(2)脉冲作用对象为水平磁化向量(nonresonanteffects) 频偏较大时射频场的有效磁场接近Z向，因此横向磁化向量在脉冲期间绕Z轴有额外的进动，产生相移： 此处<>对脉冲串作平均，在多维谱中当p随间接维时间变化时（如去偶序列），这个相移在对应的间接维中表现为一个频移该图显示的是脉冲宽度58.4s的180度脉冲对横向磁化产生的额外相移。b组合脉冲(compositepulse) 一般脉冲都受频偏，射频场不均匀等的影响，特别是180度脉冲。利用几个脉冲组合在一起，完成一个所需的旋转，就是组合脉冲。其设计多样，目的不尽相同。其效果往往同初始状态有关。作用于Z向的180度脉冲最简单的可用90x180y90x代替。 效果见图3.20(p.140)c自旋去偶 在异核实验中，一个核的演化过程中另一个核加连续波照射，可产生去偶效应，但所需的功率太大。而在一个回波序列中若仅有一个核加180脉冲而与其有J偶合的另一核不加脉冲，则在回波点上J偶合不起作用，但回波期间仍起作用。若将整个期间分成许多短的回波序列，J偶合起作用的时间相对减少，极限情况下，一连串180脉冲期间，J偶合起作用的时间更少，这时就起到自旋去偶的作用。由于180脉冲的性能不佳，通常用组合脉冲来代替180脉冲。并加上各种循环使其效果更好。 若R代表180度组合脉冲，代表这个组合脉冲中所有脉冲的相位均反转的结果，下面的超循环产生更好的效果： (1)WALTZ系列，基本单元是90x180-x270x,记为 如WALTZ-16: (2)GARP序列，更多的组合脉冲去偶要靠computeroptimization GARP序列由组成，其中R为：30.5055.2180257.80268.318069.3062.218085.0091.8180134.50256.118066.4045.918025.5072.7180119.50138.2180258.4064.918070.9077.218098.20133.6180255.9065.518053.40d选择脉冲 在许多核磁实验中需要选择激发或选择抑制技术。 最简单的选择脉冲是低功率的方波（软脉冲）： 图中可见，方波激发有效范围大约,缺点在于激发有相当的边带。 核磁谱仪的发展是引入成形脉冲发生器，将一个脉冲分成几百甚至几千个方波脉冲，每步的强度及相位均可控制，这样可以产生不同的激发曲线。但直至今日，要产生完全理想的选择激发仍是非常困难的。 图中可见，Gauss成形脉冲的选择性较方波好，但相位受频偏的影响较大。 此图仍然是同一个Gauss成形脉冲，但每个小脉冲的相位加一个线性变化，其激发曲线的形状不变，但激发峰点移动。 参见图3.23-3.25(pp.147-149) 此图显示的是一种所谓绝热脉冲的形状，其特征是相位迅速变化，而且是非线性的，因此射频激发的瞬间频率从激发谱的一端扫描到另一端，在脉冲作用期间，一个核感受到的有效场矢量从Z向转向－Z向，其扫描速度慢于核磁矩绕有效场的进动频率即所谓绝热条件，在这种情况下，核磁矩与有效场矢量同步地运动，也从Z向转向－Z向，而受频偏的影响很小，所以作为180度宽带选择脉冲是非常理想的。 由图中可见其激发频谱非常宽而且边界变化快。最近几年对绝热脉冲的研究相当多，不断有新的脉冲形状被设计出来。5水峰抑制技术 生物样品如蛋白质和核酸的核磁实验通常要在水中进行，因为生理环境是水溶液。而水的浓度达110M，因而水峰信号的抑制成为实验成功的一个关键。水峰信号的特点：a强度大，较一般生物样品高出4－5个数量级，导致ADC饱和b水的强信号有一个新的现象，即radiationdamping: 水的横向磁化向量在探头的线圈中诱发出感生电动势，由于此电动势极强，又与水的横向磁化向量本身作用，使其快速返回到Z向，其时间常数为,因此虽然水本身的T1时间在秒的量级，radiationdamping使其信号回复到Z向的时间仅有几十毫秒，这样也使水峰变得很宽。c水信号还能同样品中的活泼氢交换 解决措施：a利用高纯度重水，还可进行重氢交换实验，但最终所有可交换的活泼氢都消失，其中包括对结构解析非常重要的NH质子b预饱和c选择激发d选择抑制e数据处理(1)预饱和 最基本，最简单的方法，通常在脉冲的弛豫恢复期间加低功率的射频照射(大约50Hz左右)，持续1－2秒，这种方法对蛋白质可用，但有一定条件: 通常蛋白质主链上的NH与水的交换在pH3附近最慢，因此用于记录核磁谱的蛋白质溶液的pH一般调节在3－5之间，尽管在这样条件下，N端的NH由于与水交换太快，加射频照射时的饱和转移也使N端的NH被饱和而不能观察到；若pH在中性附近乃至碱性，则交换太快，而不能用预饱和。 核酸碱基上的氨基及亚氨基尤其是亚氨基与水的交换较蛋白质高出1－2个数量级，加上核酸结构中的氢键在中性附近才稳定，一般溶液的pH在7左右，因此核酸的核磁实验不能用预饱和。 水峰抑制的效果同样品的磁场均匀程度有很大关系，也与样品本身的性质如黏度等有关。(2)Jump-return/Binomialsequences 属于选择激发，但水峰抑制程度偏小，适用于比较简单的脉冲序列。常用的有,等。(3)spin-lock/gradientpulses 参见图3.28(p155) 尤其是WATERGATE及waterflip-back技术效果较好，在多维谱中用的很多6一维谱的一般步骤a样品准备 样品要求可溶，通常样品管装样量为0.4-0.6ml,一般用5mm样品管，标记样品特别是大蛋白要有1－2mM,非标记的小蛋白可更高一些。 样品必须离心，除去悬浮颗粒，不能有顺磁性的污染。 样品在所用溶液状态下必须足够稳定，因为核磁实验经常要数周至数月时间。 由于不同pH，不同温度下样品中化学位移的分散程度不一，尽量寻找最佳条件。 很多蛋白质的一定条件下特别是浓溶液中会聚集，形成多聚体，要尽量避免。b调谐 线圈在插入样品管后要影响其谐振状态包括品质因子等，所以实验前首先要调节探头状态，使其谐振频率对准所用的射频频率，同时探头的输入阻抗与放大器的输出阻抗匹配，这样才能将射频能量有效地传送到探头，否则反射回去的能量会损坏放大器等。c锁场 所有样品必须含有锁场介质，现代谱仪一般都用氘锁，所以即便是水溶液，也要加5-10%的重水。锁场既提供场频连锁机制，及时补偿磁场的漂移，也为匀场提供一个手段。d匀场 就是调节室温匀场线圈的电流，使磁场尽量均匀。判别匀场好坏的标准通常用锁场信号的强弱或直接观察FID的形状。e脉冲宽度的校正 不同样品特别是氢的90度脉冲宽度不一样，脉宽正确与否对简单的一维谱关系不大，但对二维三维谱很重要，必须仔细测量。通常观测180度或360度脉冲的效果来测量90度脉宽。 谱仪上表征射频场功率强度用衰减分贝（Bruker仪器），即分贝值越大，射频功率越小： 此处P为功率，V为电压，由于产生的磁场强度与电压成正比，核磁矩围绕磁场进动的频率又与磁场强度成正比，因此此处V可用进动频率代替。而进动频率的倒数即周期或360度脉宽，故两个90度脉冲宽度的比值的对数乘以20就是这两个脉冲功率的分贝值之差。记住：这个分贝是衰减分贝。这样可以从一个功率下的脉宽推算其他功率下的脉宽，实际的脉宽会有一些差别，这要视仪器的线性程度。 通常氢的脉冲宽度可直接观测来测定，其他通道的核的脉宽可直接测（需要浓样品或标记样品），或间接测(图3.33,p171)f循环延迟 一般要大于T1,对小肽需要1秒多，大蛋白质小于1秒即可。g定标 早期核磁实验一定要有定标物质（或内标，或外标），现代数字化谱仪可以精确确定射频场频率，可以由锁场信号的位置间接计算。 一般生物样品溶于水中，同时为水峰抑制缘故，射频场频率常放在水峰位置