血红蛋白的提取和分离课件高二下学期生物人教版选修1

课题3

血红蛋白的提取和分离课题背景课题背景课题背景蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术阅读教材P64~66，思考下列问题基础知识1、选择什么细胞提取血红蛋白？2、蛋白质分离的原理是？常用方法？哺乳动物红细胞1.蛋白质分离的原理：

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。方法凝胶色谱法

电泳法

基础知识2、分离的方法基础知识1、什么是凝胶？常见的凝胶有哪些？2、什么是凝胶色谱法？是依据什么特性来分离蛋白质？3、凝胶色谱法的原理？（一）凝胶色谱法思考基础知识（一）凝胶色谱法1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成，如葡聚糖、琼脂糖）2、凝胶色谱法：也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法.3、依据的特性：相对分子质量的大小基础知识（一）凝胶色谱法4、凝胶色谱法的原理相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部路程较长速度较慢相对分子质量较大的蛋白质在凝胶外部移动路程较短速度较快相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离5、具体过程基础知识（一）凝胶色谱法洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

5、具体过程基础知识（一）凝胶色谱法基础知识（一）凝胶色谱法相对分子质量大相对分子质量小运动路径运动方式运动路程运动速度洗脱次序凝胶外部凝胶內部垂直向下运动无规则的扩散运动较短较慢较快较长先流出后流出根据凝胶色谱法的原理填表基础知识（二）电泳思考1、什么是电泳？2、电泳的原理？3、常用的电泳方法有？1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2、原理（1）许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。基础知识（二）电泳（2）在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。（3）电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离基础知识（二）电泳3、常用方法琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳4、实例使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量思考：1、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于什么？

2、怎么去除净电荷对迁移速率的影响?它所带净电荷的多少以及分子的大小

加入SDS基础知识（二）电泳SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链。因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS所带负电荷量大大超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别。电泳迁移速率完全取决于分子的大小基础知识（二）电泳凝胶色谱法和电泳法的比较凝胶色谱法电泳法分离依据分离动力分子大小的影响相对分子质量大小分子带电性质差异、分子大小和形状等重力电场力相对分子质量大，移动速度快分子大，阻力大，移动速度慢基础知识（三）缓冲溶液1、缓冲溶液的作用是什么？如何配置？2、在本实验中使用缓冲溶液是什么？它的目的是什么？思考基础知识（三）缓冲溶液1、作用在一定范围内，能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变2、缓冲溶液的配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。特别提醒：本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)实验操作阅读教材P66-67回答下列问题1、蛋白质的提取和分离的步骤？2、为什么选择提取分离血红蛋白？这一特点对进行蛋白质的分离有何意义？3、提取血红蛋白选择哺乳动物的红细胞作为实验材料有什么优点？血红蛋白是有色蛋白

凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。哺乳动物成熟的红细胞内没有细胞核和各种细胞器，血红蛋白含量丰富，也能排除了其他物质对实验结果的干扰。样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定实验操作（一）样品处理1、红细胞的洗涤思考（1）洗涤红细胞的目的？你如何知道红细胞已经洗涤干净？如何洗涤？（2）为何要重复多次洗涤红细胞？（3）为何要低速短时间离心？（4）能否用蒸馏水代替生理盐水洗涤红细胞？上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无法完全除去血浆蛋白。因为离心速度过高、时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离红细胞的效果。蒸馏水会导致红细胞破裂，使血红蛋白与血浆蛋白等混在一起，增加分离的难度。实验操作（一）样品处理1、红细胞的洗涤（1）洗涤目的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。（2）洗涤操作采集血样低速短时间离心吸取上层透明的黄色血浆下层红细胞液体倒入烧杯加五倍体积生理盐水缓慢搅拌10min低速短时间离心重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色实验操作（一）样品处理2、血红蛋白的释放思考（1）本步操作的目的是什么，如何进行？（2）操作中加入蒸馏水和甲苯的作用分别是？（1）目的：使红细胞破裂，释放出血红蛋白（2）过程加蒸馏水到原血液体积

加40％体积的甲苯置于磁力搅拌器搅拌10min红细胞破裂，释放出血红蛋白使红细胞吸水胀破溶解细胞膜实验操作（一）样品处理思考3、分离血红蛋白溶液（1）本步操作的目的是什么，如何进行？（2）血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层？如何获得血红蛋白溶液？（1）目的：经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。（2）过程将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min实验操作（一）样品处理（3）结果：离心后试管中的溶液分为4层3、分离血红蛋白溶液有机溶剂(无色透明)脂类物质(白色固体)血红蛋白水溶液(红色透明)杂质沉淀(暗红色)（4）分离用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体实验操作（二）粗分离思考（1）粗分离采用什么方法，如何进行操作？（2）该操作的目的是？利用得原理？（1）操作：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时（2）目的透析除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液（3）原理透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内实验操作（三）纯化—凝胶色谱操作阅读教材P67-69回答下列问题1、总结凝胶色谱法的操作步骤2、色谱柱填料该如何处理？3、分析为什么凝胶的装填要紧密均匀？为什么不能有气泡？怎样证明色谱柱制作成功？打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。1、凝胶色谱柱的制作：实验操作（三）纯化—凝胶色谱操作取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平底塞的制作顶塞的制作橡皮塞打孔

安装玻璃管组装将上述三部分按相应位置组装成一个整体实验操作（三）纯化—凝胶色谱操作2、凝胶色谱柱的装填（1）凝胶的选择：交联葡聚糖凝胶（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克（2）凝胶的前处理配置凝胶悬浮液计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液操作提示：商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。可将湿凝胶用沸水浴加热。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。实验操作（三）纯化—凝胶色谱操作（3）凝胶色谱柱的装填固定将色谱柱处置固定在支架上装填将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀思考为什么凝胶的装填要紧密均匀？以降低凝胶颗粒之间的空隙，以免空隙影响洗脱次序装填时为什么不能有气泡？因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果怎样证明色谱柱制作成功？如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功实验操作（三）纯化—凝胶色谱操作（4）洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时注意1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象实验操作（三）纯化—凝胶色谱操作3、样品加入与洗脱调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面洗脱收集分装蛋白质打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口用吸管沿管壁环绕移动，将1ml样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口加入20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）到适当高度连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集注意：1.不要触及破坏凝胶面；2.贴壁加样；3.使吸管管口沿管壁环绕移动实验操作（四）纯化鉴定：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS---聚丙烯酰胺凝胶电泳。目的蛋白观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞等一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？结果分析与评价2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。结果分析与评价3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：（1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：

、

、

和

。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。①加入柠檬酸钠的目的是

。②以上所述的过程即是样品处理，它包括

、

、收集血红蛋白溶液。样品处理粗分离纯化纯度鉴定防止血液凝固红细胞洗涤血红蛋白的释放课堂练习

（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是

。

②透析的原理是

。