DB61-T 1814-2024 化妆品抗皱功效测试技术规范

ICS71.100.70CCSY42DB61Technicalspecificationforcomesticsanti-wrinklingeffic陕西省市场监督管理局发布IDB61/T1814—2024前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14基本要求 25测试准备 36测试 47数据处理 58测试报告 59质量保证 5DB61/T1814—2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由陕西省药品监督管理局提出并归口。本文件起草单位：陕西省食品药品检验研究院、陕西博溪通用检测科技有限公司、陕西省药品和疫苗检查中心、陕西省药品技术审评中心、咸阳市食品药品检验检测中心。本文件主要起草人：冯润东、曹涵博、蔡虎、刘海静、卢永波、杨文娟、李潇、吴小勇、王莉芳、党琳琳、罗阿利、张若冰、李晓春、孙若曦。本文件首次发布。本文件由陕西省食品药品检验研究院负责解释。联系信息如下：单位：陕西省食品药品检验研究院电话址：陕西省西安市高新区科技五路21号邮编：7100651DB61/T1814—2024化妆品抗皱功效测试技术规范本文件规定了化妆品抗皱功效测试的基本要求、测试准备、测试、数据处理、测试报告和质量保证的要求。本文件适用于化妆品体外成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T622化学试剂盐酸GB/T646化学试剂氯化钾GB/T678化学试剂乙醇（无水乙醇）GB/T1263化学试剂十二水合磷酸氢二钠（磷酸氢二钠）GB/T1266化学试剂氯化钠GB/T1274化学试剂磷酸二氢钾GB/T3102.6光及有关电磁辐射的量和单位GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T21395二甲基亚砜SN/T3899化妆品体外替代试验良好细胞培养和样品制备规范3术语和定义SN/T3899界定的以及下列术语和定义适用本文件。3.1抗皱anti-wrinkle有助于减缓皮肤皱纹产生或使皱纹变得不明显。3.2紫外光辐照强度ultravioletlightirradiance入射到某一表面的紫外光（如UVA）的强度，单位为瓦每平方米（W/m²)或毫瓦每平方厘米（mW/cm²)。2DB61/T1814—20243.3紫外光辐照剂量ultravioletlightirradiationdose入射到某一表面的紫外光（如UVA）的量（强度×时间），单位为焦耳每平方米（J/m²)或焦耳每平方厘米（J/cm²)。3.4酶联免疫吸附测定法enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA将抗原或抗体结合在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性结合以及抗体或者抗原上标记的酶催化特定底物发生显色反应，实现目标物检测的免疫分析方法。4基本要求4.1环境要求4.1.1与细胞相关的实验操作应在无菌环境下进行，洁净度应达到100级要求，环境温度应控制在20℃~24℃,环境湿度应控制在50%～70%，防震动，防电磁干扰。4.1.2其他试验操作应在常规实验室环境下进行，生物安全等级达到一级要求。4.2耗材和试剂4.2.1一般要求所用试剂应为分析纯，试验用水应按GB/T6682的要求进行制备。与细胞培养相关试剂、耗材应作无菌处理。4.2.2耗材耗材应满足下列要求：a)细胞培养瓶为25cm2、75cm2培养瓶；b)细胞培养板为6孔平底细胞培养板；c)无菌离心管规格为1.5mL、15mL、50mL；d)移液器枪头规格为10μL、200μL、1000μL；e)过滤器孔径为0.22μm。4.2.3试剂试剂应满足下列要求：a)低糖Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium培养基（DMEM）；b)新生牛血清应符合SN/T3899的要求；c)磷酸二氢钾（KH2PO4）应符合GB/T1274的要求；d)十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）应符合GB/T1263的要求；e)氯化钠（NaCl）应符合GB/T1266的要求；f)氯化钾（KCl）应符合GB/T646的要求；g)盐酸（HCl）应符合GB/T622的要求；h)无水乙醇应符合GB/T678的要求；i)转化生长因子-β1（TGF-β1）粉末纯度≥95%；3DB61/T1814—2024j)二甲基亚砜应符合GB/T21395的要求；k)酶联免疫试剂盒：用于检测人Ⅰ型胶原蛋白含量，灵敏度<0.188ng/mL，检测范围0.313ng/mL~20ng/mL。4.3试剂配制试剂配制应满足以下要求：a)细胞培养液：取90mLDMEM培养液，添加10mL新生牛血清，混合均匀，冷藏保存，有效b)磷酸盐缓冲溶液（0.1M，pH7.4称定0.27g磷酸二氢钾、2.87g十二水合磷酸氢二钠、8.00g氯化钠和0.20g氯化钾加水800mL溶解，用盐酸调pH至7.4，并加水定容至1000mL，过滤除菌，冷藏保存，有效期14d；c)TGF-β1溶液（100ng/mL）：称定0.002mgTGF-β1，溶于1mL细胞培养液中，配置成0.002mg/mL的母液，使用0.22μm过滤器进行过滤除菌，冷冻保存，有效期28d，使用时用细胞培养液稀释成100ng/mL的TGF-β1溶液；d)酶联免疫吸附测定法相关试剂应按照试剂盒说明书配制所需溶液。4.4仪器设备仪器设备应符合下列要求：a)细胞培养箱条件为37℃,5%CO2，95%相对湿度；b)超净工作台洁净度达到100级；c)分析天平精度为0.0001g；d)超低温冰箱温度为-40℃~-86℃;e)倒置显微镜放大倍数为100倍～400倍；f)酶标仪检测波长范围为200nm～999nm；g)UVA辐照仪波长范围为315nm～400nm；h)紫外线照度计量仪的光谱效应范围应包含315nm～400nm；i)高速冷冻离心机转速为1000r/min～14000r/min，可制冷至4℃;j)微孔板振荡器速度为0r/min～1000r/min；k)移液器量程为2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL；l)细胞计数仪测量范围为5×104个细胞/mL~1×107个细胞/mL。5测试准备5.1细胞准备5.1.1应采用人源皮肤的原代成纤维细胞，以含10%新生牛血清的DMEM细胞培养液为基础培养液于细胞培养箱中培养。5.1.2测试前，宜取冷冻保存的成纤维细胞进行复苏培养，传代培养到P7代时，以2×105个细胞/孔的密度接种到6孔细胞培养板中，每个试验组准备3个复孔。置于细胞培养箱中孵育24h±2h后用于试验。5.2样品制备5.2.1受试物的配制4DB61/T1814—2024应根据受试物理化特性选择合适的溶剂配置成受试物工作液，配制要求如下：a)水溶性物质：宜选细胞培养液作为溶剂，配置成高浓度母液（母液中受试物的浓度应为试验浓度的10倍～1000倍），过滤除菌，然后使用细胞培养液稀释到试验浓度；b)非水溶性物质：宜选二甲基亚砜或无水乙醇作为溶剂，配置成高浓度母液（母液中受试物的浓度应为试验浓度的100倍～11000倍），过滤除菌，其中二甲基亚砜或无水乙醇的体积在溶液中应当低于1%。5.2.2受试物浓度的选择应通过细胞毒性试验确定受试物安全浓度范围，以受试物处理细胞后细胞活力≥90%时的浓度为安全浓度的最高浓度，在安全浓度范围内，选择1个～3个浓度作为受试物试验浓度。5.3试验分组试验过程中应按如下要求分组：a)空白对照组：使用细胞培养液培养细胞，不进行UVA辐照；b)阴性对照组：使用细胞培养液培养细胞，进行30J/cm²的UVA辐照剂量辐照；c)阳性对照组：使用含有阳性物的细胞培养液培养细胞，进行30J/cm²的UVA辐照剂量辐照，阳性物宜选择具有促进成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的活性物，如100ng/mLTGF-β1；d)受试物组：使用含有一定浓度的受试物的细胞培养液培养细胞，进行30J/cm²的UVA辐照剂量辐照。5.4仪器准备UVA辐照仪开关打开后应稳定15min±2min。使用紫外线照度计量仪对UVA辐照仪的辐照强度进行校准，确保UVA辐照仪辐照强度稳定。6测试6.1受试物孵育应弃掉培养孔中的细胞培养液，更换新的培养液，操作过程按照5.3要求进行，各试验组细胞孵育时间宜为24h±2h。6.2UVA辐照6.3UVA辐照过程应在无菌操作环境下进行，清洗并更换细胞培养液为磷酸盐缓冲溶液，每孔添加量为1mL。按照5.3试验分组进行UVA辐照，辐照剂量宜为30J/cm2。照射时间计算见式（1t=H/E.....................................................................................(1)式中：t——照射时间，单位为秒（s）；H——辐照剂量，单位为毫焦每平方厘米（mJ/cm2E——辐照强度，单位为毫瓦特每平方厘米（mW/cm2）。6.4换液UVA辐照结束后，应将磷酸盐缓冲液更换为新的培养液，各试验组细胞孵育时间宜为24h±2h。5DB61/T1814—20246.5细胞上清液收集及保存孵育培养结束后，每孔应收集不少于1mL细胞培养液，用于检测；如需储存应储存于超低温冰箱，有效期90d。6.6检测应对细胞培养液离心，离心转速宜为12000r/min、时间不小于10min。离心后收集上清液，按照Ⅰ型胶原蛋白酶联免疫试剂盒说明书所述方法进行稀释及测定。7数据处理7.1Ⅰ型胶原蛋白含量计算按照试剂盒说明书提供的计算方法计算，每组应取3个复孔的平均值作为检测结果，结果表示为平均值±标准差（Mean±SD）。7.2统计分析数据应使用t检验分析显著性差异，双尾检验。与阴性对照组相比，p<0.05则认为其具有统计学差异。7.3精密度试验中每组3个复孔的检测数据间的变异系数（CoefficientofVariation，C.V）应≤20%。变异系数计算见式（2式中：C.V——变异系数；SD