第四章核酸操作的基本技术

第四章核酸操作的基本技术新疆农业大学农学院第四章核酸操作的基本技术核酸的操作技术是基因工程最基本的技术之一在基因工程技术中，研究的对象和材料都涉及到核酸核酸技术包括：核酸的提取与纯化、检测与保存、凝胶电泳、分子杂交等第一节核酸的提取与纯化制备核酸的根本要求：保持核酸的完整性，既保持天然状态细胞内核酸酶活力很高，防止核酸酶对核酸的降解防止化学因素（酸、碱等）和物理因素（高温、机械剪切等）RNase分布广，活力很高（RNA)DNA分子长、容易断裂，防止张力剪切作用第一节核酸的提取与纯化提取纯化核酸分为三大步细胞破碎除去与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质除去其他杂质核酸一、基本原理（一）化学试剂提取法CTAB法SDS法（二）离心分离法（一）化学试剂提取法CTAB法CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

（一）化学试剂提取法SDS法研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。

质粒pBSSKpET28c(+)pBSKSChiA（二）离心分离法根据核酸长度大小的不同进行纯化超速离心凝胶电泳超速离心根据样品的质量来进行分离，称为速度区带离心沉降的速度与样品的质量、密度、离心力大小、介质的摩擦力大小有关。根据样品的密度大小不同而进行分离，称为密度梯度离心质量和密度大的颗粒比小的沉降快，介质密度与样品的密度相等时，样品停止移动，停留在该介质密度的位置上氯化铯密度梯度离心法溴化乙锭(EB)是一种吖啶类染料，它可以插入DNA的碱基对之间，使DNA的体积增大，浮力密度变小。EB容易插入线状的DNA，而与环状质粒DNA的结合量小于与线状染色体DNA的结合量，从而使两者的浮力密度出现悬殊的差别，更利于离心时分离。

氯化铯密度梯度离心法CsCl是一种高分子量的重金属盐。在高速离心条件下，就会在离心管中形成CsCl密度梯度。将DNA样品加EB与CsCl一起离心，当DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡状态时，DNA就形成一稳定的区带。在合适的CsCl密度梯度范围中，DNA就处在一定的位置上，这时DNA的浮力密度就等于该位置上的CsCl的密度。由于质粒DNA的浮力密度大于线状染色体DNA的浮力密度，染色体DNA的区带在上层，质粒DNA的区带在下层。两者能明显地分开而达到分离的目的。氯化铯密度梯度离心法在提取的样品中，还含有大量RNA。一般来说，DNA与RNA的浮力密度是与CsCl、H20相互作用有关，而RNA在CsCl中总是与Cs+相结合，故密度很大。在超速离心时，RNA将沉入离心管底，这样就可以与质粒DNA相分离。（三）一般过程供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA

分离细胞器分离总RNA

分离细胞器DNARNApoly(A)RNA

特异性RNA

染色体DNA(组建基因组文库)

DNA分离纯化过程

破碎细胞+DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂)65℃温育20’冰浴冷却离心去细胞碎片苯酚抽提法①

CsCl密度梯度离心②①苯酚抽提法上清液缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥溶于缓冲液加入RNAase处理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥

酚/氯仿抽提DNA蛋白质②

CsCl密度梯度离心

上清液加入固体CsCl与EtBr溶液室温下超速离心(45,000rpm）16小时穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透析除去残余CsCl

两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs细胞器DNA的分离植物组织用核分离缓冲液匀浆过滤滤液离心(2000g,10’,4℃)核缓冲液使核裂解(含0.5%TritonX-1抽提DNA植物组织细胞器缓冲液匀浆离心(100g,10’,4℃)除去细胞核离心(1800g,10’,4℃)分离叶绿体离心(10,000g,10’,4℃)分离线粒体DNase除去细胞器外DNA加入EDTA使DNase失活纯化细胞器细胞器裂解提取DNA质粒载体DNA的分离关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开原理：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型

质粒载体DNA的分离超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法RNA的分离与纯化制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(0~65℃均具活性）；抗变性剂解决办法外源RNase—高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等RNA的分离与纯化破碎细胞核蛋白复合体充分变性，即使核蛋白迅速与核酸分离抑制内源RNase以及污染的外源RNase的活性将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开细胞裂解物

胍盐法

总RNA分子杂交法—

特异RNA分子

热苯酚法凝胶电泳围RNA大小分级分离大小范蔗糖密度梯度离心

一定

LiCl/核酸序列

尿素法离心分级分离亲和层析法—poly（A）RNA分子

高速离心法

全部多聚核糖体

上清液镁盐沉淀法蔗糖密度梯度离心—结合与游离多聚核糖体分级分离法

蔗糖连续密度—一定范围大小核糖体多聚核糖体RNA免疫沉淀法——特异性多聚核糖体

第二节核酸的检测与保存一、核酸的检测二、核酸的保存一、核酸的检测紫外光谱分析法通常以A260值为1相当于50ug/mL双螺旋DNA，或40ug/mL单链DNA(或RNA),或20ug/mL寡核苷酸计算核酸的纯度纯DNA的A260/A280应大于1.8纯RNA的A260/A280应大于2.0一、核酸的检测荧光分析法采用荧光物质转移的待测物质结合，通过测定荧光的强度来间接测定待测物质的浓度及含量凝胶电泳法估计DNA的浓度二、核酸的保存影响核酸保存的关键因素保存液的酸碱度保存温度核酸制品的保存方法第三节核酸的凝胶电泳在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团成离子化状态，DNA和RNA的多核苷酸链呈现出多聚阴离子的特性在电场中向正极移动，在一定电场下，分子量小的比较大迁移的要快些第三节核酸的凝胶电泳

种类

按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易第三节核酸的凝胶电泳用途琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。凝胶电泳的一般程序制胶点样电泳染色观察（一）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种天然聚合长链状分子(线性多糖聚合物)，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。（二）用琼脂糖凝胶电泳分析核酸的影响因素凝胶浓度DNA分子的大小与构象电泳缓冲液指示剂：溴酚兰（bromophenol

blue,Bb)呈蓝紫色；二甲苯腈（xylene

cyanol,Xc)蓝色染色琼脂糖含（%）DNA片段的有效分离范围(kb)0.35-600.51-300.61-200.70.8-121.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1-3分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度植物总（核）DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带。质粒DNA应呈现一到三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区是样品中存有的RNA杂质。若质粒DNA样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。常用的电泳缓冲液4℃保存备用.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别分离物质。介质既具有分子筛效应，又具有静电效应，分辨率高于琼脂糖凝胶电泳。适用于低分子DNA（1~1000bp）、蛋白质、寡核苷酸的分离和DNA的序列分析。具有分离只相差一个核苷酸的不同DNA片段的特性。聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PAG）的聚合反应单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；催化剂：过硫酸胺或核黄素；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶的优点分辨率高比琼脂糖凝胶的载样量大回收的DNA样品纯度极高在聚丙烯酰胺凝胶分子的交联网状结构中，带有酰胺侧链的C-C聚合物不带或少带离子侧链基团聚丙烯酰胺凝胶无色透明，比琼脂糖凝胶的紫外线吸收低、抗腐蚀性强、机械强度高、韧性好聚丙烯酰胺凝胶电泳的一般程序缓冲液：TBE；染色：银染法垂直的圆盘电泳和板状电泳制胶点样电泳染色观察AFLP的银染检测结果三、脉冲场凝胶电泳普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。分子量大的DNA分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。脉冲时间是一个人为的固定值，用于向前移动的时间则随分子量大小而变化。分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。使不同大小分子量DNA分离的假说。脉冲场凝胶电泳原理图北

南

脉冲场电泳常规电泳

两组电极，排列不均匀;一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，定时改变电场方向，DNA分子的净DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与两电场呈45o，在电泳过过程保持电压稳定。常规方法制备DNA程中，电压有时可随时间的增加而样品增加，制备DNA样品与常规方法不同第四节核酸分子杂交一、探针的制备二、核酸杂交核酸分子杂交的基本原理具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。DNA变性DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等一、探针的制备探针（probe)：是指经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。DNA杂交—探针为DNA或RNARNA杂交—探针为DNA或cDNA（一）同位素标记探针32P

，3H

，35S

用于核酸标记，其中32P和35S使用频率高。32P标记核苷酸的α位或γ位，35S则是标记核苷酸的α位.（二）非同位素探针生物素标记探针地高辛标记探针辣根过氧化物酶标记探针生物素标记探针生物素是一种水溶性维生素，可通过烯丙键与嘧啶环的C5位共价结合。生物素标记的dUTP(biotin-II-dUTP)可代替dTTP而被合成进DNA探针，这种探针能特异的与抗生素蛋白（avidin)结合。抗生素蛋白上结合的碱性磷酸酶可使反应中的底物产生颜色，从而显示探针所在位置。GCTTGAGCAGTAACCTG显色酶Biotin生物素Avidin

生物素结合蛋白烷烃连接臂生色底物颜色产物生物素标记探针dUTP-连接臂-甾醇半抗原digoxigeninDIG抗体-显色酶交联复合物地高辛标记探针Dig-dUTP通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针杂交加抗地高辛-酶的复合物—加底物—显色辣根过氧化物酶（HRP)标记探针HRP与带正电荷的聚乙烯亚胺（polyethyleneimine)交联结合，带正电荷的复合物与带负电荷的单链或双链DNA结合，在戊二醛烯溶液作用下，HRP与DNA形成共价键，产生