基因检测技术在临床中的应用简介课件

基因检测技术应用于临床诊断遗传病的诊断无创产前诊断临床个体化用药HLA检测目前已发现的人类遗传性疾病达数千种之多，分为单基因缺陷造成的遗传病（包括显性遗传、隐性遗传、X-染色体连锁遗传病等）、多基因缺陷导致的复杂因素遗传病以及染色体数目异常的遗传病新一代测序技术的特点和优势一次检测即可获得所有遗传病相关基因的突变信息，全面解析携带特征清晰的结果报告，包括详细的基因检测结果和遗传病基因的携带情况说明一、遗传病诊断CE技术在遗传病检测中的应用遗传病GeneticVariation–FixedMutationDetectionCysticFibrosis（囊性纤维化）FragileX(Tri-nucleotiderepeatexpansion)脆性X综合征（三核苷酸重复片段扩增突变）SpinocerebellarAtaxia(脊髓小脑萎缩症)

Galactosemia(半乳糖血症)GeneticVariation–VariableMutationDetectionCNV（基因拷贝数检测）HLA-TypingHLA配型（器官移植配型）HFE(Hemochromatosis)血色素沉着症Charcot-MarieTooth1A腓骨肌萎缩症1A型Beta-Thalessemia地中海貧血Connexin26(Hearingloss)常染色体隐性非综合征性耳聋DuchenneMuscularDystrophy假肥大型肌营养不良Huntington’sDisease亨廷顿病性痴呆MitochondrialDisordersGenePanel线粒体紊乱ARX-relateddisordersRMRPBeta-Globindisordersβ-地中海贫血“OTHER”–Abucketofotherlowvolumegeneticteststhathavevariablemutations(MarfanSyndrome,NoonanSyndrome,LeopardSyndrome,Hypertrophiccardiomyopathy,Ushersyndrome,HHT,etc.)

疾病类型疾病名称相关基因耳聋相关遗传性耳聋COL11A2，GJB2，GJB3，GJB6，KCNQ4，SLC26A4心血管相关扩张型心肌病ABCC9，ACTN2，BAG3，DES，LAMP2，LDB3，PLN家族性肥厚型心肌病ACTC1，CALR3，CAV3，MYH6/7，MYL2/3QT间期延长综合征AKAP9，KCNE1/2，KCNH2，KCNQ1，SCN4B，SNTA1肌肉相关先天性肌无力综合征CHAT，CHRNA1，CHRNB1，CHRND/E，DOK7，RAPSN肌营养不良症CAPN3，DMD，EMD，FRG1，LMNA其他遗传病帕金森病FBXO7，LRRK2，PINK1，SNCA，TAF1苯丙酮尿症PAH地中海贫血症HBA2，HBB血友病F8，F9依据ACMG（美国医学遗传学与基因组学学院）指南，数百种严重的早发性隐性遗传病和智能障碍疾病相关的基因可以通过新一代测序技术获得快速，全面的诊断疾病类型疾病名称相关基因免疫相关丙种球蛋白血症BTK重症联合免疫缺陷ADA，IL2RG，RAG1/2脑神经相关早发性家族性阿尔茨海默病APP，PSEN1，PSEN2家族性自主神经功能障碍IKBKAP脊髓小脑共济失调ATXN1，ATXN2，ATXN7代谢相关槭糖尿病BCKDHA，BCKDHB，DBT，DLD半乳糖血症GALT发育相关短趾GDF5，ROR2软骨发育不良FGFR3躯干发育异常SOX9Mitochondrialgenesofdeafness：A1555GDeepsequenceforheteroplasmydetection

(>1000xcoverageonIon314)Abilitytodo16samplesperrunwithbarcodingAccuratevariantcalling,especiallyinhypervariableregionsofmitochondriaHumanMitochondrialSequencingMutationdetectedonposition15450Prof/.StefanSchusterPenn.StateUniversityRapidresequencingofmitochondrialgenomesfordiseaseresearch,biodiversityassessment线粒体DNA突变筛查线粒体疾病----13个编码多肽的基因6编码产物基因分析基因变异对应的常见线粒体病种类NADHdehydrogenase(complexI)MT-ND1Leber遗传性视神经病MT-ND2心肌线粒体病，Leber遗传性视神经病MT-ND3进肌阵挛，癫痫，视神经萎缩MT-ND4Leber遗传性视神经病，线粒体肌病，Leber遗传性视神经病，张力障碍MT-ND4LLeber遗传性视神经病MT-ND5Leigh综合征，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症MT-ND6Leber遗传性视神经病，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症，糖尿病，肌张力障碍coenzymeQ-cytochromecreductase/Cytochromeb(complexIII)MT-Cytb慢性游走性红斑，Leber遗传性视神经病，线粒体肌病，心肌线粒体病，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症，帕金森病cytochromecoxidase(complexIV)MT-COX1肌红蛋白尿运动神经元疾病，铁粒幼细胞贫血MT-COX2线粒体肌病，线粒体多系统疾病，线粒体脑肌病MT-COX3Leigh综合征，慢性游走性红斑，骨骼肌溶解症ATPsynthaseMT-ATP6共济失调并发色素性视网膜炎，母系遗传Leigh综合征，家族性双侧纹状体坏死MT-ATP8共济失调并发色素性视网膜炎，母系遗传Leigh综合征，家族性双侧纹状体坏死

67线粒体疾病----22个编码tRNA的基因

AlanineMT-TA进行性眼外肌麻痹ArginineMT-TRAsparagineMT-TN线粒体肌病，进行性眼外肌麻痹AsparticacidMT-TD心肌线粒体病，肌阵挛CysteineMT-TC慢性游走性红斑GlutamicacidMT-TE心肌线粒体病，慢性游走性红斑GlutamineMT-TQ线粒体肌病，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症GlycineMT-TG心肌线粒体，婴儿猝死综合征，慢性游走性红斑HistidineMT-THIsoleucineMT-TI线粒体肌病，心肌线粒体病，进行性眼外肌麻痹LeucineMT-TL1慢性进行性眼外肌麻痹，Leer遗传性视神经病，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症，线粒体肌病，心肌线粒体病，糖尿病和线粒体耳聋MT-TL2心肌线粒体病，慢性游走性红斑，慢性进行性眼外肌麻痹，线粒体肌病，铁粒幼红细胞性贫血LysineMT-TK心肌线粒体病，慢性进行性眼外肌麻痹，肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症，线粒体耳聋MethionineMT-TM线粒体肌病，淋巴瘤PhenylalanineMT-TF线粒体脑肌病、乳酸中毒以及卒中样发作，骨骼肌溶解症ProlineMT-TP线粒体肌病，进行性眼外肌麻痹SerineMT-TS1掌跖角化症，线粒体耳聋，肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维-线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症MT-TS2糖尿病和线粒体耳聋ThreonineMT-TT心肌线粒体病，慢性游走性红斑TryptophanMT-TWLeigh综合征，共济失调舞蹈病，线粒体肌病TyrosineMT-TY慢性进行性眼外肌麻痹ValineMT-TVLeigh综合征，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症，线粒体多系统疾病12SribosomalRNAMT-RNR1帕金森病，氨基糖甙类抗生素致聋16SribosomalRNAMT-RNR2心肌线粒体病二、产前诊断应用之一-无创产前诊断技术传统技术的局限无创产前诊断技术无创产前诊断—检测母亲血浆游离胎儿DNA

9无创产前诊断实验流程1无创产前诊断实验流程2二、产前诊断应用之二----胚胎移植前单基因遗传病检测（PGD）胚胎植入前遗传学诊断（PGD）：又称为孕前诊断，是胚胎植入子宫之前进行的遗传学诊断，仅将遗传学正常的胚胎植入子宫，是积极性优生的一种方式。与妊娠到中期抽取羊水进行产前诊断技术相比，孕前诊断因为植入正常的胚胎，避免了产前诊断发现胎儿异常后需要进行选择性流产的缺点。

12Trisomy13Trisomy18试管婴儿胚胎植入前单细胞检测染色体多倍性单细胞扩增基因组DNA，利用高通量测序平台检测染色体多倍性只需要约reads即可分析染色体多倍性1-2天可出检测报告二、产前诊断应用之三---胚胎移植前染色体多倍性检测（PGS）132012年8月24日，全球首例接受全基因组测序技术筛查的试管宝宝在湖南健康出生，体重2.4公斤。科学家对体外发育至第5天的7个囊胚取样。待检细胞内的遗传物质提取后被运送至华大基因进行检测，其中3个胚胎鉴定为染色体核型正常。医生选择2个正常的胚胎进行植入，病人顺利单胎妊娠。华大基因使用了新一代测序技术，来实现PGD&PGS三、临床个体化用药肿瘤应用：肿瘤的早期诊断：肿瘤的个体化治疗各个公司推出的cancerpanel的目的范例1Li-Fraumeni综合症Li-Fraumeni综合症（LFS）是常染色体显性癌症易染综合症，与青少年时一系列肿瘤的发生相关。LFS患者易发生多发原发肿瘤包括骨肉瘤，软组织肉瘤，乳腺肿瘤，脑肿瘤，肾上腺皮质肿瘤，急性白血病，胰腺肿瘤，胃肿瘤，黑色素瘤，Wilms’瘤及其他肿瘤。P53突变携带者发生癌症的估计风险为85-90%。LFS为常染色体显性遗传癌症易感综合症，患者的每一个孩子都有50%机会感染LFS，遗传疾病相关致病基因突变。家族性腺瘤性息肉病（FAP）FAP临床表现多样。除典型FAP外，目前已经发现3种FAP类综合症：轻表型家族性腺瘤性息肉病（AFAP），Gardner综合症和Turcot综合症。AFAP表现为少于100个（平均30）腺瘤样息肉，主要见于近端结肠，但发展为大肠癌的几率很高。AFAP患者诊断为结肠癌的平局年龄为50-55岁。Gardner综合症是FAP的一种变异形式，除有结肠腺瘤样息肉外，还具有肠外的表现如下颌骨和长骨骨瘤，软组织肿瘤（上皮样囊肿、纤维瘤及硬纤维瘤等）。Turcot综合症系指结肠多发息肉联合中枢神经系统肿瘤。诊断为FAP的75%患者来自于遗传，25%患者为新的突变所致。尽管家族内或家族间有着本病表型的一些变异，几乎所有携带突变APC的患者都会发展为FAP。美国临床肿瘤协会（ASCO）等推荐基因检测作为对于FAP家族高危成员标准处理的手段之一。

范例2遗传性非息肉病性结直肠癌（HereditaryNon-PolyposisColorectalCancer，HNPCC)遗传性非息肉病性结直肠癌（HereditaryNon-PolyposisColorectalCancer，HNPCC),又称为Lynch综合症,指家族中发生结直肠癌或其他相关肿瘤如子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、小肠肿瘤、肝胆系上皮肿瘤、皮肤及脑部肿瘤等风险增大。HNPCC占所有结直肠癌中的3-5%。HNPCC患者在有生之年患结直肠癌的风险大约为80%。三分之二的患者肿瘤位于近端结肠。HNPCC结直肠癌患者典型发病年龄（44岁）要小于普通人群。因此这些患者不太可能在结肠癌的常规筛查中被发现。vonHippel-Lindau(VHL)综合症VHL综合症是常染色体显性遗传性肿瘤。它以脑，脊髓和视网膜的血管母细胞瘤、肾囊肿和透明细胞癌、嗜铬细胞瘤、内淋巴囊肿瘤及附睾或阔韧带的乳头状囊腺瘤等为特征。家系内和家系间患者的临床表现及疾病严重程度可能大不相同。80%确诊为VHL的患者遗传自家族成员，20%为新突变所导致。基因检测是对于有风险的VHL家族成员使用标准手段之一。除了可明确临床诊断的患者外，基因检测有助于在VHL极高风险患者显示出典型的临床表现之前进行早期确诊和干预。如果无症状的患者突变被证实，建议高度重视并进行常规和连续的门诊随访。范例3

遗传性弥漫性胃癌可分为遗传性弥漫型胃癌和家族性肠型胃癌。为常染色体显性遗传。其特点包括：基因外显率高（70%～80%），发病年龄早（平均38岁），病理类型一致，均为弥漫性胃癌（皮革胃）。该病没有早期诊断方法，胃镜检查及盲目胃活检不能早期发现病变。对于有明确突变的家庭成员而言，年轻时死于胃癌的风险很大，预防性全胃切除术是一种合理的选择。家族性胰腺癌综合症(familialpancreaticcancer,FPC)家族性胰腺癌是已经被确定的遗传肿瘤综合症,占全部胰腺癌的3%左右。对FPC的检查有利于发现胰腺癌的高危人群,包括家族中出现胰腺癌的其他成员和其他遗传肿瘤综合症：如皮肤黏膜黑色素斑-胃肠道多发性息肉综合症(Peutz-Jeghers综合症)、家族性非典型恶性黑色素瘤、家族性乳腺卵巢癌综合症、遗传性非腺瘤性结直肠癌等。对该综合症的确诊有助于更加准确地预测胰腺癌发病的危险,加强对高危人群的随访和及时的根治性手术是改善预后的重要方法。范例4遗传性乳腺癌-卵巢癌综合症Lynch等于1972年首次描述了乳腺癌-卵巢癌综合症，并于1992年定义了3种明确的遗传性卵巢癌综合症：①遗传性非息肉性结肠直肠癌综合症(即LynchⅡ型)。②遗传位点特异性卵巢癌综合症。③遗传性乳腺癌-卵巢癌综合症。后者为3种综合症中最为常见的一种。携带BRCA1突变基因的乳腺癌妇女自确诊时起5年内患乳腺癌的风险为25%，至70岁时为64%。遗传性乳腺癌-卵巢癌综合女性症者患乳腺癌和(或)卵巢癌的发生率将大大增加，男性患者极易罹患睾丸癌。Cowden病（CD）：PTEN基因种系突变引起的常染色体显性遗传病，特征是引起多种错构瘤和肿瘤。小脑的胚胎发育不良性神经节细胞瘤（Lhermitte-Duclos病）是其主要的中枢神经系统表现。神经系统外表现包括皮肤疣、口腔粘膜的卵石样丘疹和纤维瘤、多发面部毛根鞘瘤、结肠错构瘤性息肉和乳腺癌。检测类似上述案例的基因，就可以在一定程度上达到早期诊断的目的随着测序成本的进一步下降，科研能力的进一步提升，会有更大量的疾病相关基因被解码，为临床诊断提供更多的依据基因检测对临床治疗的改变传统的治疗方式基因导向的治疗方式LungAdenocarcinomaTesting

ParadigmTestforKRASMutationsCytotoxicChemotherapy(15-30%)TestforEGFRMutationsTestforEML4-ALKtranslocationTestforotherMutations?*EGFRTyrosineKinaseInhibitor(10%)ALKKinaseInhibitor(5-10%)-+-+-+Testforacquiredresistance(eg.EGFR_T790M)(*)“Other”includesBRAF,MEK1,AKT1,PIK3CA,DDR2……and/orintensiveresearchtoidentifynewdrivermutationsImagebaseonHornLandPaoW:EML4-ALK:Honinginonanewtargetinnon-small-celllungcancer.JClinOncol27:4232-4235,2009TargetedTherapiesinCancerOncogeneTargetedTherapeuticTreatmentPharmaBCR-ABLImatinib(Gleevec)*格列卫LeukemiaNovartisHER2Trastuzumab(Herceptin)赫赛汀BreastCancerRoche(Genentech)c-KITPDGFRImatinibGIST胃肠道间质瘤NovartisSunitinib(Sutent)舒尼替尼PfizerEGFRGefitinib(Iressa)吉非替尼，易瑞沙Breast,NSCLCAstraZenecaErlotinib(Tarceva)盐酸厄洛替尼NSCLCPancreaticRoche(Genentech)Cetuximab(Erbitux)曲妥珠单抗CRCHead&NeckBMSmTOREverolimus(Afinitor)依维莫司Multi-cancerNovartisPIIItrialsMETCrizotinib(Xalkori)克唑替尼NeoplasmsPfizerBRAFVemurafenib(Zelboraf)威罗菲尼MelanomaDaiichiEML4-ALKCrizotinib(Xalkori)克唑替尼NSCLCPfizerARMDV3100(抗雄激素药物Abiraterone)ProstatePIIItrialTargetedTherapiesinCancerTargetingSignalTransductionPathwaysinMetastaticBreastCancer:AComprehensiveReview.Rosenetal.TheOncologist2010增殖K-ras带有K-ras突变的结肠癌患者对西妥昔单抗的疗效降低K-ras变异和恶性肿瘤的抗-EGFR治疗12,13外显子(96%)and61

12外显子35G>A(甘

天门冬）为主GCTGATGCCGCetuximab(西妥昔单抗)无效应EGFRTKG细胞膜突变K-rasK-ras的功能突变不受上游信号控制个体化用药能够提高结肠癌的药物疗效Langreth,R.(2008),‘Imclone’sGeneTestBattle’,F,16May

K-ras基因型检测

不用西妥昔治疗用西妥昔治疗

西妥昔治疗

治疗成功

临床意义结直肠癌：①预测预后②指导临床用药结肠癌：PIK3CA(+)预后不良直肠癌：PIK3CA(+)局部复发PIK3CA突变对Cetuximab和Panitumumab的治疗耐药。OginoS,etal.JClinOncol.2009;27:1477-1484.HeY,etal.ClinCancerRes.2009;15:6956-6962.Sartore-BianchiA,etal.CancerRes.2009;69:1851-1857.个体化用药降低结肠直肠癌治疗费用-美国治疗有效者平均每人节省60%费用40%疗效不好的病人避免罕见副作用有效率没有改变，为25%Langreth,R.(2008),‘Imclone’sGeneTestBattle’,F,16May进行Kras检测不进行Kras检测是否进行Kras检测实行爱必妥个体化治疗费用的比较$0$50,000$100,000$150,000$200,000平均治疗费用/人平均治疗费用/有效病人个体化用药降低结肠直肠癌治疗费用–我国西妥昔临床用法：每周注射一次。初始量第一周400mg/m2，随后每周250mg/m2。按中国人平均体表面积计算，第一次用7瓶（100毫克/瓶），以后每次用4瓶。4400元/瓶。首次量：4400×7=30800元；其后每次：4400×4=17600元。西妥昔停用指针为肿瘤进展（药物治疗无效，病情恶化）。西妥昔治疗患者肿瘤无进展中位时间为16周，也即注射16次，合计费用为294800元。K-ras基因突变患者可平均节约30万元。

有效者

改用其它治疗最佳治疗效果(高效、低毒)易发生毒性降低剂量或改用它药以基因检测为基础的个体化用药

无效者

MarkersassociatedwithwidelyuseddrugsonFDAwebsite

31318long-rangePCR:enhancer-promoterto3’UTRRoche454Junior平台：10个标本，每次运行检测一个标本，成本约$1500persample。每个标本平均100Kreads，41Mb碱基，有效匹配碱基，测序深度IonTorrent平台：一张316芯片同时检测4个标本，成本约$70perlocuspersample。每个标本平均650Kreads，130Mb碱基，45Mb有效匹配碱基。所以一张316芯片可同时检测更多的标本，成本更低。四、HLA分型1----器官移植（低成本高精度）HLA分型常用于组织器官移植前的供体/受体

相容性检验HLA基因型检验GeneNo.AllelesHLA-A349HLA-B626HLA-C182HLA-DRB1390HLA-DQB160HLA-DPB1116为什么要多样性?从群体的角度,保证人体对病原体压力下的广泛和多种的免疫应答

高通量测序平台向临床推广的重要因素：

操作简单快速、运行成本低卡马西平：用于治疗癫痫、躁狂、抑郁症和神经病理性疼痛的药物

不良反应--引起重症多形性红斑（SJS），中毒性表皮坏死松解症（TEN）

有不良反应病人特征：携带等位基因HLA-B*1502

台湾23家医院4877个病例进行等位基因HLA-B*1502检测，非携带者使用卡马西平治疗，携带者使用其他替代药物治疗，产生不良反应病例为为0。而不经等位基因HLA-B*1502检测，直接使用卡马西平进行治疗引起不良反应的概率为0.23%。药物治疗疾病不良反应检测等位基因卡马西平癫痫、躁狂、抑郁症等SJS，TENHLA-B*1502阿巴布韦艾滋病