低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞增殖

低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞增殖及其机制的研究Thestudyofhypoxicmicroenvironmentpromotingolfactorymucosamesenchymalstemcells(OM-MSCs)toproliferateanditsmechanism背景—干细胞春天

干细胞移植治疗神经损伤及修复一直是神经学科界研究的热点。目前，有研究证实胚胎干细胞、神经干细胞、多能干细胞等均对神经修复治疗有效，而这些细胞仍然存在着一些如：伦理、免疫排异及细胞来源不足等问题。间充质干细胞（MSCs）背景—间充质干细胞

种子细胞Seedwhatisit?背景—OM-MSCs2008年研究者在人鼻嗅黏膜中发现嗅黏膜间充质干细胞（olfactorymucosamesenchymalstemcells，OM-MSCs）[1]，也称为外胚间充质干细胞(OE-MSC)，同时又被称为固有层间充质干细胞(LP-MSC)。Lindsay,S.L.,Riddell,J.S.,andBarnett,S.C.(2010).Olfactorymucosafortransplant-mediatedrepair:acomplextissueforacomplexinjury.Glia58,125–134.Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.OM-MSCs可表达间充质干细胞的标记物，同时也具有自己的特点基因聚类分析提示，OM-MSCs与BMSCs是密切相关，具有同源性的。Delorme,B.,Nivet,E.,Gaillard,J.,Haupl,T.,Ringe,J.,Deveze,A.,Magnan,J.,Sohier,J.,Khrestchatisky,M.,Roman,F.S.,etal.(2010).Thehumannoseharborsanicheofolfactoryectomesenchymalstemcellsdisplayingneurogenicandosteogenicproperties.StemCellsDev.19,853–866.Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.OM-MSC背景—OM-MSCs脂肪组织、骨组织诱导Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.Delorme,B.,Nivet,E.,Gaillard,J.,Haupl,T.,Ringe,J.,Deveze,A.,Magnan,J.,Sohier,J.,Khrestchatisky,M.,Roman,F.S.,etal.(2010).Thehumannoseharborsanicheofolfactoryectomesenchymalstemcellsdisplayingneurogenicandosteogenicproperties.StemCellsDev.19,853–866.相比BMSC，OM-MSCs展现出更强大的增殖效率和更短的倍增时间。背景—OM-MSCs增殖迅速背景—OM-MSCs分布广泛OM-MSCs不受获取部位的影响，广泛获取上鼻甲、中鼻甲、下鼻甲、鼻中隔，皆可培养出OM-MSCs，且培养出的细胞生物学特性没有差异。aged10–19yearsaged20–39yearsaged40–59yearsaged60–75years10–19y

20–39y40–59y60–75y志愿者的年龄不会影响OM-MSCs的增殖活力和生物学特性Hwang,S.H.,Park,S.H.,Choi,J.,Lee,D.C.,Oh,J.H.,Yeo,U.C.,Kim,S.W.,andSun,D.I.(2013).Age-relatedcharacteristicsofmultipotenthumannasalinferiorturbinate-derivedmesenchymalstemcells.PLoSOne8,e74330.背景—OM-MSCs安全性Shafiee,A.,Kabiri,M.,Ahmadbeigi,N.,Yazdani,S.O.,Mojtahed,M.,Amanpour,S.,andSoleimani,M.(2011).Nasalseptum-derivedmultipotentprogenitors:apotentsourceforstemcell-basedregenerativemedicine.StemCellsDev.20,2077–2091.通过慢病毒转染绿色荧光蛋白，转染后>98%细胞转染绿色荧光蛋白。体内和体外致瘤的实验，在体外的软琼脂。OM-MSCs不会在软琼脂增殖，而MKN45肿瘤细胞系会出现典型的细胞克隆球。在体外注射OM-MSCs和MKN45肿瘤细胞系到免疫缺陷的小鼠上，MKN45细胞可出现明显的肿瘤发生，而OM-MSCs注射部位未见明显肿瘤发生。OM-MSCs作为新发现的一类间充质干细胞，不仅具有间充质干细胞的一般特性，相比BMSC还具有以下优点[2]

:1)具有更高的增殖效率和更短的传代时间2)来源于外胚层，相当于BMSC、ADSC等细胞来源于中胚层，OM-MSCs来源于外胚层无需跨胚层分化为神经元3)来源稳定，嗅粘膜可终身更新，广泛分布鼻腔内，易于取材4)不受年龄限制，其生物学活性不随年龄的增长而改变5)安全性高，染色体核组分析和肿瘤基因分析显示体外无限传代后没有基因变异背景—OM-MSCs

目前，我们于国内首次成功培养出了OM-MSCs并做了相关鉴定及成功建立了OM-MSCs培养体系。已发表与OM-MSCs培养鉴定相关文章背景—OM-MSCs有研究已证实了低氧能显著影响BM-MSCs与人胚胎干细胞的增殖及细胞因子的分泌功能常规细胞体外培养的氧气浓度约为21%，C02浓度约为5%，而人体正常组织和组织间隙中的氧气浓度为3%-9%对于细胞增殖、功能都有着极为重要的作用2RenH,CaoY,ZhaoQ,etal.Proliferationanddifferentiationofbonemarrowstromalcellsunderhypoxicconditions.BiochemBiophysResCommun.2006.347(1):12-21.ForristalCE,WrightKL,HanleyNA,OreffoRO,HoughtonFD.Hypoxiainduciblefactorsregulatepluripotencyandproliferationinhumanembryonicstemcellsculturedatreducedoxygentensions.Reproduction.2010.139(1):85-97.背景—低氧微环境

通常将小于10%的氧气浓度称为低氧，但此浓度仍比人体正常组织及组织间隙的氧气浓度要高，人体正常组织及组织间隙中的氧气浓度约为3%-9%，血液中氧浓度约为1%-13%，而骨髓腔内氧气浓度仅1%-7%，所以本实验我们选取3%O2的微环境来培养OM-MSCs，同时观察研究低氧对其细胞增殖能力及细胞活性的影响。

低氧装置WangY,YangJ,LiH,etal.HypoxiapromotesdopaminergicdifferentiationofmesenchymalstemcellsandshowsbenefitsfortransplantationinaratmodelofParkinson'sdisease.PLoSOne.2013.8(1):e54296.背景—低氧微环境IsolationandCultureofhOM-MSCs.ExperimentalDesignRNAExtractionandRT-PCR.ELISA.OM-MSChypoxemiaHIF-1α技术路线图结果Fig.1OM-MSCs的形态学特征.A:贴壁细胞从组织块中爬出，并显示出纺锤形外观及放射状的排列顺序；.B-C:免疫荧光结果显示：细胞表达MSC标志物：Nestin、STRO。Scalebars:(a)50μm;(b)200μm;(c)200μm.CBFig.1OM-MSCs的形态学特征.D:流式细胞学术鉴定；细胞表达MSC标记物：CD73,CD90,andCD105,不表达造血干细胞标记物：CD34andCD45。结果结果

3％O2组3％O2组+YC-1组常氧组（21％O2）Fig.2：三组均在各自环境下培养光镜图。A-C：B图的细胞数量显著增多，A图细胞数介于中间，C图细胞数最少，说明低氧环境下能促进OM-MSCs的增殖。Fig.2：三组均在各自环境下培养后细胞计数统计图。D：细胞数量统计图（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。结果DFig.3：低氧微环境促进OM-MSCs增殖的细胞周期流式检测。A：为各组细胞周期检测结果；结果AFig.3：低氧微环境促进OM-MSCs增殖的细胞周期流式检测。B：百分比统计结果表格，其中PI（增殖系数）={(S+G2/M)÷(GO/1+S+G2/M)}×100％；结果显示3％O2组的PI值大于21％O2组（**代表P<0.01，*代表P<0.05）n=3。C：统计结果图（*代表P<0.05）n=3。结果BCFig.4：三组均在各自环境下培养72h后对其细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）进行Westernblot检测。检测结果显示:3％O2组中PCNA蛋白表达最高，3％O2+YC-1组的表达介于中间，而常氧组的表达最少，B图为A图的统计结果分析图。此结果进一步证实了低氧具有促进OM-MSCs增殖的作用（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。结果A3％O221％O23％O2+YC-1PCNAActinBFig.5：用细胞流式检测各组OM-MSCs的凋亡情况。A：为各组细胞流式凋亡结果图，B：为统计结果分析，结果显示各组存活细胞及凋亡细胞比例无显著统计学差异（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。A结果B结果ABFig.6：HIF-1α及下游靶基因TWIST的Q-PCR检测A：本实验通过Q-PCR检测各组HIF-1αmRNA表达情况显示：低氧组中HIF-1α表达量最高，加了HIF-1α抑制剂的抑制剂组中HIF-1α表达仅为B组的一半，常氧组中HIF-1α表达则明显最低。B：TWIST表达与HIF-1α一致。结果CDFig.6：HIF及下游靶基因TWIST的westernblot检测C：低氧组中HIF-1α表达量最高，加了HIF-1α抑制剂的抑制剂组中HI