《3.2 基因工程的基本操作程序》讲义案

学而优·教有方PAGE试卷第=1页，共=sectionpages33页PAGE13.2基因工程的基本操作程序目标导航目标导航课程标准目标解读基因工程是一种重组DNA技术。阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。阐明基因工程的原理和基本操作程序。针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。课前预习课前预习一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1)概念：用于改变或获得等的基因。 (2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是。2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的和的基因中进行筛选。(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的，也对Bt基因的表达产物——有了较为深入的了解。(3)认识基因结构和功能的技术方法：技术、数据库、工具。3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是的缩写，它是一项根据的原理，在体外提供的各种组分与反应条件，对进行大量复制的技术。(2)原理：(3)条件：参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用代替)打开DNA双链DNA母链提供的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链引物使能够从引物的端开始连接维持反应体系pH稳定（4）过程：PCR过程包括三步（填图）(5)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成形式扩增(约为，其中n为数)。提醒：①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。二、基因表达载体的构建——核心1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中，并且可以给下一代。(2)使目的基因能够和发挥作用。2．基因表达载体的组成[填图]3．构建过程[填图]易错易混辨析：1.目的基因就是指编码蛋白质的基因()2.从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。（） (√)3.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物()5．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。（）6．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。 ()三、将目的基因导入受体细胞（注意：只有该步骤没涉及到碱基互补配对现象）1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内和的过程。2．目的基因导入受体细胞的方法(1)目的基因导入植物细胞①法Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入中。Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入。②农杆菌转化法Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染植物和植物；农杆菌的Ti质粒上的能够整合到所侵染细胞的上。Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌中，让农杆菌侵染植物细胞。(2)目的基因导入动物细胞①常用方法：法。②常用受体细胞：。(3)目的基因导入微生物细胞①方法：用处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将基因表达载体导入其中。②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。四、目的基因的检测与鉴定1．分子水平的检测(1)通过等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。2．个体生物学水平的鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。五．DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验基础①PCR原理：利用了原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的等有关。2.PCR实验操作步骤3.DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为_nm的紫外灯下被检测出来。4.注意事项(1)为等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行。(2)PCR所用的应分装成小份，并在储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须。所有成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液，再放入中进行反应。易错易混辨析：1．将基因表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 ()2．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。（）3.应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达()4.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达()5.为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体()6.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达()7.检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术()8.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20℃储存()9.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关()10.为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换()一、目的基因的筛选与获取1.（1）受体细胞性状预期表达产物（2）Bt抗虫蛋白基因2.（1）已知结构功能清晰（2）序列信息Bt抗虫蛋白（3）测序序列序列比对3.（1）聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因的核苷酸序列(2)DNA半保留复制（3）条件：参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用高温代替)打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料耐高温的DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸缓冲液维持反应体系pH稳定变性、复性和延伸（5）指数2n扩增循环次二、基因表达载体的构建1.（1）稳定存在遗传（2）表达2.3.易错易混辨析：×√√√××三.1.维持稳定表达2.（1）花粉管通道子房胚囊双子叶裸子T­DNA染色体DNA

Ti质粒的T­DNA（2）显微注射受精卵（3）Ca2＋四、1.（1）PCR（2）抗原——抗体五．1.①DNA的热变性②相反③大小和构象2.PCR实验操作步骤3004.(1)避免外源DNA高压灭菌(2)缓冲液和酶-20℃缓慢融化(3)更换混合均匀集中在离心管底部PCR仪易错易混辨析：√××√×√√×××知识讲解知识讲解知识点一目的基因的筛选与获取1．目的基因主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。2．获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。②基因文库的种类：基因组文库：包含一种生物所有的基因；部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。cDNA文库与基因组文库的区别文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)无有基因数量某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以③从基因文库中获取目的基因的方法：用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因。根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。基因文库中变性的DNA片段，如果有一个DNA片段能和探针片段互补结合成杂交链，这一片段即含有所需的目的基因。(2)利用PCR获得和扩增目的基因①含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。需要具备的条件有模板、原料、引物、酶、控制温度等。②原理：利用DNA半保留复制原理，在体外将目的基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量成指数形式扩增(约为2n，其中为扩增循环的次数)。③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。④PCR的反应及其作用条件作用在一定的缓冲液(含Mg2+)中进行提供相对稳定的pH环境；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活4种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料DNA母链作为DNA复制的模板Taq酶(耐高温)催化合成DNA子链引物使Taq酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸温度控制90℃以上变性：使DNA片段双链解开50℃左右复性：使解开的两条DNA单链分别与相应的引物结合(退火)72℃左右延伸：Taq酶催化子链合成⑤扩增的过程：第一步：将反应体系(包括双链模板、引物、Taq酶、4种脱氧核苷酸以及酶促反应所需的离子等)加热至90℃以上，使双链DNA两条链之间的氢键打开，变成单链，分别作为聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至50℃左右，使引物分别与模板DNA链3'端的相应序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至72℃左右，在Taq酶的催化作用下，将与模板DNA互补的单个核苷酸加到引物所提供的3'—OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的单链DNA。如图所示：上述三步反应完成后，一个DNA片段就变成了两个DNA片段，随着重复次数的增多，DNA的数量就以约2n的倍数增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪(PCR仪)中完成的。完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。知识点二基因表达载体的构建1．基因表达载体的构建是基因工程的核心。其中心内容是使目的基因与运载体结合，形成重组运载体，最后通过重组运载体将目的基因导入受体细胞。2．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。3．基因表达载体的组成及其作用(1)目的基因：外源DNA分子中有遗传效应的片段。(2)启动子：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。(3)终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录结束点。(4)标记基因的作用：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。3．基因表达载体的构建过程(1)用一定的限制酶切割载体，使其出现一个黏性末端(或平末端)的切口。(2)用限制酶切割目的基因，产生与载体一样的黏性末端(或平末端)。(3)将切下的目的基因片段与载体混合，再加入适量DNA连接酶，使载体与目的基因结合成重组DNA分子(如图)。知识点三将目的基因导入受体细胞1．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是将目的基因整合到受体细胞的基因组中，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动植物细胞。2．将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和载体的类型不同，所采用的导入方法也不同，见下表。细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术Ca2+处理法(CaCl2)受体细胞受精卵或体细胞受精卵常用原核细胞转化过程农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。操作过程：将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头；然后滴加DNA(含目的基因)至花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→将注射了目的基因的受精卵经早期胚胎培养后移入母体子宫或输卵管→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞感受态细胞→将重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收外源DNA分子知识点四目的基因的检测与鉴定1．检测目的：目的基因导入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。2．检测对象(1)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因。(2)检测目的基因是否转录出了mRNA。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。3．检测方法类型检测内容方法结果显示分子水平检测目的基因是否插到受体细胞的DNA上从转基因生物中提取DNA，用标记的目的基因作探针，进行DNA分子杂交如果显示出杂交带，表明日的基因已插入染色体DNA上目的基因是否转录出mRNA从转基因生物中提取mRNA，进行分子杂交(DNA和mRNA之间杂交)如果显示出杂交带，表明转录成功目的基因是否翻译成蛋白质从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交如有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品个体水平鉴定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同转基因生物的抗性接种实验：比较基因工程产品与天然产品的功能活性是否赋予了预期抗性或蛋白质活性知识点五DNA片段的扩增及电泳鉴定1．实验原理(1)DNA片段的扩增①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。(2)DNA片段的电泳鉴定①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。2．材料用具(1)仪器：PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)(2)用具：4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。3．方法步骤(1)DNA片段的扩增(2)DNA片段的电泳鉴定课后拓展课后拓展拓展01基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取除了PCR（利用PCR技术扩增目的基因）和人工合成（如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。）外，也可从基因文库中获取。基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。基因表达载体的构建基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核苷酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（重组质粒）的。然而，由于外源DNA片段和载体的黏性末端均相同，因而在连接反应中外源DNA片段和质粒DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物,而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须调整连接反应中两种DNA的浓度,以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉,最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连,产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入大肠杆菌（E.coli）受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。也可用两种不同的限制酶切割产生非互补的黏性末端。一般情况下,常用质粒均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源DNA片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。将目的基因导入受体细胞1.导入植物细胞：（1）花粉管通道法花粉管通道法是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。这一技术原理可以应用于任何开花植物。基因枪法基因枪法，又叫粒子轰击细胞法或微弹技术。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（如：将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，形成粘有DNA

的细微金粉、金粒或钨粒），以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用较低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。（3）农杆菌转化法农杆菌是指生活在植物根表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源目的基因向植物细胞的转移和整合，再通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。2.导入动物细胞：显微注射法显微注射法是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源目的基因直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。将从胚胎提供者的输卵管中取得的受精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管固定住，之后注射针则依序穿过透明带、卵黄膜及雄原核膜（malepronuleusmembrane），将重组DNA注入受精卵的原核中，可以见到原核膨大。操作时，如果显微注射针尖太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。（注：专有名词翻译有待进一步确定）3.导入微生物：感受态细胞法①将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。细胞壁通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。②将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。③将转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。目的基因的检测与鉴定1.DNA分子杂交法（DNA探针法）DNA分子杂交的基础：具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子解旋成为单链，这个过程称为变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链用同位素进行标记。如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。2.分子杂交分子杂交其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。3.抗原-抗体杂交Western杂交，即蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。与SouthernBlot或NorthernBlot杂交方法类似，WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。拓展02PCR的基本原理聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR是利用DNA在体外95°C高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪是一个温控设备，能在变性温度、复性温度、延伸温度之间很好地进行控制。一般循环25～30次，就能将目的基因扩增放大几百万倍。但循环数并不是无限增加的。一般循环数30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加。PCR反应时需要的条件有：（1）引物：PCR引物有两条，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。细胞内DNA复制的引物为一段RNA链。（2）酶：TaqDNA聚合酶（3）dNTP：四种脱氧核苷酸（4）模板：PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。（5）缓冲液：需要Mg2+。PCR反应扩增出了高的拷贝数后要进行检测。琼脂糖凝胶电泳是最常用的检测手段。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。琼脂糖凝胶电泳中，影响DNA分子迁移率的因素有：DNA的大小及构型、琼脂糖浓度、DNA的构象、电源电压、嵌入染料的存在、离子强度影响等。背诵笔记背诵笔记笔记01第一步：目的基因的筛选与获取1.在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。因此Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。2.获取目的基因的方法有多种。常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。3.PCR反应的过程（如下图）笔记02第二步：基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的。(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够表达和发挥作用。2．基因表达载体的组成3．基因表达载体的构建的过程笔记03第三步：将目的基因导入受体细胞1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2．目的基因导入受体细胞的方法受体细胞类型方法说明特点植物细胞农杆菌转化法将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T­DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达简便、经济，我国科学家独创的一种方法动物细胞显微注射技术将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物将目的基因导入动物细胞最为有效的方法微生物细胞Ca2＋处理法(感受态细胞法)用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子简便、经济、有效笔记04第四步：目的基因的检测与鉴定1．分子水平检测。(1)通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。2．个体水平鉴定。包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。笔记05实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定（一）实验原理1．DNA片段的扩增。2．琼脂糖凝胶电泳（二）方法步骤2．混合。3．离心。4．反应。5．根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制合适的琼脂糖凝胶，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。6．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔。7．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5_V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。8．电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。（三）操作提示1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。课后自测课后自测1．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如下图1所示。下列叙述错误的是（

）A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因D．经五轮循环后产物中有五种不同长度的DNA分子2．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列相关叙述错误的是（

）A．凝胶有一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物B．同一个凝胶中，DNA分子越大，迁移的速率越快C．染色的DNA分子可在300nm紫外灯下被检测出来D．移液器上的枪头在每吸取一种试剂后都必须进行更换3．下列有关PCR技术的叙述，错误的是（）A．PCR是对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术B．该技术的原理是DNA的半保留复制C．反应中的每次循环可分为变性、复性和延伸三步D．扩增过程中需要解旋酶参与打开DNA双链结构4．下列关于利用乳腺生物反应器生产药用蛋白的叙述，正确的是（

）A．需要将编码药用蛋白的基因与能在乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起B．需要将目的基因导入乳腺细胞中C．需要借助于核移植技术和胚胎移植技术培育出转基因动物D．药物的生产不会受到转基因动物性别和年龄的限制5．下列关于基因工程及操作步骤的叙述，错误的是（

）A．与基因工程的操作有关的酶至少有两种B．DNA连接酶对“缝合”序列不进行特异性识别C．若受体细菌能表达质粒载体上的抗性基因，则表明重组质粒已成功导入D．DNA连接酶和RNA聚合酶都可以作用于磷酸二酯键6．下列生物工程中所用物质与其发挥的作用，对应不正确的是（

）A．蛋白酶合成抑制剂——激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育B．重组质粒——携带外源基因进入受体细胞C．琼脂——为微生物生长提供碳源D．聚合酶——催化合成新的子链7．下列有关教材实验，叙述错误的是（

）A．将15N标记的细菌转移到含14N的培养液中，可通过放射性检测来确定DNA的复制方式B．卡尔文用CO2供小球藻进行光合作用来探明碳的转移途径，该实验自变量是反应时间C．詹森和拜尔的实验没有排除胚芽鞘尖端这一结构对实验结果的影响，无法证明尖端产生的某种影响是一种化学物质D．用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物时，DNA的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小及构象有关8．科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是（

）①该技术将导致定向变异；②DNA连接酶把目的基因与运载体黏性末端的碱基对连接起来；③蛋白质中的氨基酸序列可为合成目的基因提供资料；④受精卵是理想的受体。A．①②③④ B．①③④ C．②③④ D．①②④9．下列关于细胞工程和基因工程的叙述，正确的是A．产生单克隆抗体的杂交瘤细胞在培养过程中会出现接触抑制现象B．PEG诱导融合形成的杂种细胞经动物细胞培养后能得到新品种个体C．一个模板DNA在PCR时消耗引物分子14个，则该DNA扩增了4轮D．农杆菌Ti质粒的T-DNA能将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上10．下图是4种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是（）

A．基因amp和tet是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因B．质粒包括细菌细胞中能自我复制的小型环状DNA和病毒中的DNAC．限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键D．用质粒4将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长11．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是（

）A．催化①过程的酶是RNA聚合酶B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温D．RNA单链中C与U之和占该链碱基含量一定是50%12．二倍体新疆野生油菜（P1）具有低芥酸、抗病虫等特性，为了改良二倍体甘蓝型油菜（P2），研究人员将两种植物的体细胞进行融合获得了属间杂种F1，然后加入1对引物进行PCR鉴定，结果如图所示。下列叙述不正确的是（

）注：M为标准DNA参照，F1-1和F1-2为被检测植株A．杂种F1的形成依赖细胞膜的流动性和细胞的全能性B．杂种F1含4个染色体数组C．引物能与DNA分子上相应的片段结合D．电泳结果表明F1-1具有P1、P2的全部遗传信息13．独脚金内酯（简称SLs）是一种对植物生长发育具有调控作用的新型植物激素。已知脱落酸（简称ABA）能通过提高植物含水量来提高植株的抗逆性。在研究SLs调控小麦抗旱的分子机制时，发现在干旱环境下，控制ABA合成的关键基因TaNCED1表达量上升，控制ABA分解的关键基因TaHYD1表达量下降。据此提出假说：SLs通过促进ABA的积累来提高植株的抗逆性。以下结果支持上述假说的是（

）A．野生型植株敲除TaNCED1基因后，与SLs缺陷突变株的叶片含水量无差别B．野生型植株导入TaHYD1基因后，叶片含水量降低C．SLs缺陷突变株导入TaNCED1基因后，叶片含水量提高D．野生型植株体内ABA的含量和叶片含水量均高于SLs缺陷突变植株14．为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBI121）结合，然后导入棉花细胞。下列叙述正确的是（

）A．用限制酶BsaBI和DNA聚合酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因B．与只用KpnI相比，KpnI和XhoI处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确C．在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞即为成功转入目的基因的细胞D．用PCR技术检测GNA和ACA基因成功导入棉花细胞后，棉花就一定表现抗蚜虫性状15．科学家将4个关键基因导入已分化的肌肉细胞中并表达，使这个细胞成为多能干细胞（iPS细胞），该实验过程如图所示。下列有关叙述正确的是（

）

A．应用该技术可提高器官移植的成功率 B．iPS细胞所带遗传信息与肌肉细胞相同C．导入的关键基因表达促进了肌肉细胞的分化 D．细胞分化的根本原因是蛋白质的种类不同16．农杆菌细胞内含有，当它侵染植物细胞后，能将上的转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入中，通过农杆菌的作用，就可以使目的基因进入。17．花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用将含直接注入中；可以在后的一定时间内，剪去，将滴加在花柱切面上，使目的基因借助进入胚囊。18．在基因工程操作中，常用作为受体细胞，其中以应用最为广泛。19．操作目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够作用。20．PCR的每一个循环都包括→→三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。

3.2基因工程的基本操作程序目标导航目标导航课程标准目标解读基因工程是一种重组DNA技术。阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。阐明基因工程的原理和基本操作程序。针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。课前预习课前预习一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1)概念：用于改变或获得等的基因。 (2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是。2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的和的基因中进行筛选。(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的，也对Bt基因的表达产物——有了较为深入的了解。(3)认识基因结构和功能的技术方法：技术、数据库、工具。3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是的缩写，它是一项根据的原理，在体外提供的各种组分与反应条件，对进行大量复制的技术。(2)原理：(3)条件：参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用代替)打开DNA双链DNA母链提供的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链引物使能够从引物的端开始连接维持反应体系pH稳定（4）过程：PCR过程包括三步（填图）(5)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成形式扩增(约为，其中n为数)。提醒：①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。二、基因表达载体的构建——核心1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中，并且可以给下一代。(2)使目的基因能够和发挥作用。2．基因表达载体的组成[填图]3．构建过程[填图]易错易混辨析：1.目的基因就是指编码蛋白质的基因()2.从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。（） (√)3.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物()5．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。（）6．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。 ()三、将目的基因导入受体细胞（注意：只有该步骤没涉及到碱基互补配对现象）1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内和的过程。2．目的基因导入受体细胞的方法(1)目的基因导入植物细胞①法Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入中。Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入。②农杆菌转化法Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染植物和植物；农杆菌的Ti质粒上的能够整合到所侵染细胞的上。Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌中，让农杆菌侵染植物细胞。(2)目的基因导入动物细胞①常用方法：法。②常用受体细胞：。(3)目的基因导入微生物细胞①方法：用处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将基因表达载体导入其中。②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。四、目的基因的检测与鉴定1．分子水平的检测(1)通过等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。2．个体生物学水平的鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。五．DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验基础①PCR原理：利用了原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的等有关。2.PCR实验操作步骤3.DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为_nm的紫外灯下被检测出来。4.注意事项(1)为等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行。(2)PCR所用的应分装成小份，并在储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须。所有成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液，再放入中进行反应。易错易混辨析：1．将基因表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 ()2．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。（）3.应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达()4.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达()5.为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体()6.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达()7.检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术()8.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20℃储存()9.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关()10.为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换()一、目的基因的筛选与获取1.（1）受体细胞性状预期表达产物（2）Bt抗虫蛋白基因2.（1）已知结构功能清晰（2）序列信息Bt抗虫蛋白（3）测序序列序列比对3.（1）聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因的核苷酸序列(2)DNA半保留复制（3）条件：参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用高温代替)打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料耐高温的DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸缓冲液维持反应体系pH稳定变性、复性和延伸（5）指数2n扩增循环次二、基因表达载体的构建1.（1）稳定存在遗传（2）表达2.3.易错易混辨析：×√√√××三.1.维持稳定表达2.（1）花粉管通道子房胚囊双子叶裸子T­DNA染色体DNA

Ti质粒的T­DNA（2）显微注射受精卵（3）Ca2＋四、1.（1）PCR（2）抗原——抗体五．1.①DNA的热变性②相反③大小和构象2.PCR实验操作步骤3004.(1)避免外源DNA高压灭菌(2)缓冲液和酶-20℃缓慢融化(3)更换混合均匀集中在离心管底部PCR仪易错易混辨析：√××√×√√×××知识讲解知识讲解知识点一目的基因的筛选与获取1．目的基因主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。2．获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。②基因文库的种类：基因组文库：包含一种生物所有的基因；部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。cDNA文库与基因组文库的区别文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)无有基因数量某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以③从基因文库中获取目的基因的方法：用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因。根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。基因文库中变性的DNA片段，如果有一个DNA片段能和探针片段互补结合成杂交链，这一片段即含有所需的目的基因。(2)利用PCR获得和扩增目的基因①含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。需要具备的条件有模板、原料、引物、酶、控制温度等。②原理：利用DNA半保留复制原理，在体外将目的基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量成指数形式扩增(约为2n，其中为扩增循环的次数)。③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。④PCR的反应及其作用条件作用在一定的缓冲液(含Mg2+)中进行提供相对稳定的pH环境；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活4种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料DNA母链作为DNA复制的模板Taq酶(耐高温)催化合成DNA子链引物使Taq酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸温度控制90℃以上变性：使DNA片段双链解开50℃左右复性：使解开的两条DNA单链分别与相应的引物结合(退火)72℃左右延伸：Taq酶催化子链合成⑤扩增的过程：第一步：将反应体系(包括双链模板、引物、Taq酶、4种脱氧核苷酸以及酶促反应所需的离子等)加热至90℃以上，使双链DNA两条链之间的氢键打开，变成单链，分别作为聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至50℃左右，使引物分别与模板DNA链3'端的相应序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至72℃左右，在Taq酶的催化作用下，将与模板DNA互补的单个核苷酸加到引物所提供的3'—OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的单链DNA。如图所示：上述三步反应完成后，一个DNA片段就变成了两个DNA片段，随着重复次数的增多，DNA的数量就以约2n的倍数增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪(PCR仪)中完成的。完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。知识点二基因表达载体的构建1．基因表达载体的构建是基因工程的核心。其中心内容是使目的基因与运载体结合，形成重组运载体，最后通过重组运载体将目的基因导入受体细胞。2．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。3．基因表达载体的组成及其作用(1)目的基因：外源DNA分子中有遗传效应的片段。(2)启动子：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。(3)终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录结束点。(4)标记基因的作用：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。3．基因表达载体的构建过程(1)用一定的限制酶切割载体，使其出现一个黏性末端(或平末端)的切口。(2)用限制酶切割目的基因，产生与载体一样的黏性末端(或平末端)。(3)将切下的目的基因片段与载体混合，再加入适量DNA连接酶，使载体与目的基因结合成重组DNA分子(如图)。知识点三将目的基因导入受体细胞1．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是将目的基因整合到受体细胞的基因组中，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动植物细胞。2．将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和载体的类型不同，所采用的导入方法也不同，见下表。细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术Ca2+处理法(CaCl2)受体细胞受精卵或体细胞受精卵常用原核细胞转化过程农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。操作过程：将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头；然后滴加DNA(含目的基因)至花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→将注射了目的基因的受精卵经早期胚胎培养后移入母体子宫或输卵管→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞感受态细胞→将重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收外源DNA分子知识点四目的基因的检测与鉴定1．检测目的：目的基因导入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。2．检测对象(1)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因。(2)检测目的基因是否转录出了mRNA。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。3．检测方法类型检测内容方法结果显示分子水平检测目的基因是否插到受体细胞的DNA上从转基因生物中提取DNA，用标记的目的基因作探针，进行DNA分子杂交如果显示出杂交带，表明日的基因已插入染色体DNA上目的基因是否转录出mRNA从转基因生物中提取mRNA，进行分子杂交(DNA和mRNA之间杂交)如果显示出杂交带，表明转录成功目的基因是否翻译成蛋白质从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交如有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品个体水平鉴定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同转基因生物的抗性接种实验：比较基因工程产品与天然产品的功能活性是否赋予了预期抗性或蛋白质活性知识点五DNA片段的扩增及电泳鉴定1．实验原理(1)DNA片段的扩增①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。(2)DNA片段的电泳鉴定①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。2．材料用具(1)仪器：PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)(2)用具：4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。3．方法步骤(1)DNA片段的扩增(2)DNA片段的电泳鉴定课后拓展课后拓展拓展01基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取除了PCR（利用PCR技术扩增目的基因）和人工合成（如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。）外，也可从基因文库中获取。基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。基因表达载体的构建基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核苷酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（重组质粒）的。然而，由于外源DNA片段和载体的黏性末端均相同，因而在连接反应中外源DNA片段和质粒DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物,而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须调整连接反应中两种DNA的浓度,以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉,最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连,产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入大肠杆菌（E.coli）受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。也可用两种不同的限制酶切割产生非互补的黏性末端。一般情况下,常用质粒均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源DNA片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。将目的基因导入受体细胞1.导入植物细胞：（1）花粉管通道法花粉管通道法是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。这一技术原理可以应用于任何开花植物。基因枪法基因枪法，又叫粒子轰击细胞法或微弹技术。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（如：将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，形成粘有DNA

的细微金粉、金粒或钨粒），以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用较低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。（3）农杆菌转化法农杆菌是指生活在植物根表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源目的基因向植物细胞的转移和整合，再通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。2.导入动物细胞：显微注射法显微注射法是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源目的基因直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。将从胚胎提供者的输卵管中取得的受精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管固定住，之后注射针则依序穿过透明带、卵黄膜及雄原核膜（malepronuleusmembrane），将重组DNA注入受精卵的原核中，可以见到原核膨大。操作时，如果显微注射针尖太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。（注：专有名词翻译有待进一步确定）3.导入微生物：感受态细胞法①将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。细胞壁通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。②将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。③将转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。目的基因的检测与鉴定1.DNA分子杂交法（DNA探针法）DNA分子杂交的基础：具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子解旋成为单链，这个过程称为变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链用同位素进行标记。如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。2.分子杂交分子杂交其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与R