绵羊腹腔镜活体采卵技术规程

1绵羊腹腔镜活体采卵技术规程本文件规定了绵羊腹腔镜采卵中术语和定义、供体绵羊选择、抽卵液配制及采卵操作的内容。本文件适用于绵羊腹腔镜活体采卵。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1571羊胚胎移植技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1活体采卵OvumPick-Up借助活体采卵仪或其他一些装置来完成活体状态下采集卵母细胞一系列过程。3.2供体Donor提供卵母细胞的个体。4供体绵羊的选择选择品种优良，符合品种外貌特征、谱系清楚的一级以上的羊（母羊），以1.5～6周岁为宜；产后空怀90d以上，至少有两次以上正常发情周期；体质健壮，繁殖机能正常，无遗传疾病、生殖系统疾病和传染性疫病。5抽卵液配制DPBS+10%（v:v）FBS+1mg/mLBSA+6IU/mL肝素钠+1.0%青链霉素合剂，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过滤，在0℃~5℃条件下可保存2周。6采卵操作26.1采卵前准备6.1.1供体羊准备为了便于观察卵巢并防止麻醉期间的并发症，按手术批次将羊群赶到空腹羊圈：冬季控水控料36h、夏季控水24h控料36h、哺乳期羔羊手术前12小时空腹。6.1.2手术室准备术前一天打扫手术室并用紫外线消毒60min；术前用新洁尔灭水将创布浸泡10min并甩干水分；术前30min用酒精消毒工作台。6.1.3器械消毒和摆放器械消毒：提前30min用75°酒精喷洒长臂钳、套管、穿刺针和腹腔镜镜头；酒精喷洒完5min后放入器械杯。仪器合理摆放：无菌操作台铺好无菌布；将摆放仪器杯倒入3/4的清水，水中倒入适量的碘酊；将两把长臂钳、三个套管、三个穿刺针和镜头合理摆放在仪器杯内；准备无菌刀片，如果穿刺比较困难，用刀片将穿刺部位用刀片点破，负压机摆放一旁待用。6.2穿刺操作6.2.1麻醉与保定根据“NY/T1571羊胚胎移植技术规程”进行手术准备，即用2mg/KBW氯胺酮、0.10mg/KBW地西泮和0.05mg/KBW赛拉嗪组成的混合物进行麻醉，以便插管。穿刺手术前将动物固定在保定架上，将腹侧手术区域的毛剃光。保定架呈一定倾斜度，头部处于低位，以利操作，并用2%洗必泰和1%碘液进行消毒，用干净的创布遮盖在手术部位靠下方的位置，且用创巾钳固定。6.2.2腹部穿孔穿刺前选择三个穿刺孔，穿孔时将腹部外皮向上提起，穿刺针抵住手术位置，向腹腔内空洞方向刺入；第一个腹腔镜套管穿刺针在母羊左侧乳房基部下方2～5cm处的位置刺入最佳(靠近腹中线）；第二个穿刺孔位于腹中线两侧，离乳房10～15cm；第三个穿刺孔位于右侧乳房基部3～6cm处。三个孔刺入时注意皮和腹膜的穿刺点位置不要错开，注意避开血管。6.2.3设备放置将长臂钳放入指定的穿刺孔内，用腹腔内窥镜观察穿刺套管是否进入腹腔内，如果腹部脂肪过大，导致视野内未看见套管，可用长臂钳或穿刺针拨开油脂使套管暴露在视野内。穿刺的中间孔放进长臂钳用于辅助右侧的长臂钳将卵巢固定好，固定时尽量避免不必要的损伤。右侧长臂钳将卵巢固定好，中间长臂钳拔出，将采卵针放进套管，准备采卵。6.3抽卵操作6.3.1准备工作采卵前将采卵针和吸管用抽卵液冲洗一遍，试管内采卵液不少于2mL抽卵液，要记录抽取卵泡的数量，要从下往上抽取，预防出血遮挡未抽取的卵泡6.3.2卵泡穿刺3观察卵巢后，用卵巢固定钳夹住卵巢的系带部分已固定卵巢，通过采卵针在内窥镜的观察下依次抽吸2mm以上的有腔卵泡；抽取大卵泡或抽取的卵泡液多时，要轻轻的晃动采卵液，以防止试管内的液体粘连；采卵管内抽到血时要及时进行清洗，防止在管内凝结容易粘住卵，降低回收率；采卵完成后迅速将采卵试管送回实验室内进行检卵与体外培养。6.3.3术后流程手术完