马铃薯腐烂茎线虫的室内培养技术规程

1马铃薯腐烂茎线虫的室内培养技术规程本文件规定了健康的马铃薯薯块和不同真菌对腐烂茎线虫的室内培养扩繁技术；本文件适用于土壤和马铃薯中的腐烂茎线虫室内分离、培养及鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本，适用于本文件不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和储存GB/T29577腐烂茎线虫检疫鉴定方法SN/T1132松材线虫检疫鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1马铃薯腐烂茎线虫学名及分类地位thescientificnameandclassificationstatusofDitylenchusdestructor中文名称：马铃薯腐烂茎线虫学名：DitylenchusdestructorThorne英文名：Potatotubernematode分类地位：线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernrntea）、垫刃目（Tylenchida）、粒科（Anguinidae）、茎线虫属（DitylenchusFilipjev）。3.2马铃薯腐烂茎线虫病Potatorotnematodedisease马铃薯腐烂茎线虫是危害马铃薯的重要病原线虫，主要发生在地下块茎部位，发病轻时，地上部一般没有明显症状；发病重时，地上部表现生长势弱，叶片变淡发黄。可导致马铃薯叶片黄化、萎蔫、块茎干腐等症状，导致减产和品质降低。线虫的侵染会加重真菌及细菌病害，在田间常常出现复合侵染。4试剂、培养基和引物序列24.1试剂和培养基除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。马铃薯、葡萄糖、琼脂、0.5%的次氯酸钠、0.5%青霉素、0.5%硫酸链霉素、4%甲醛溶液、10×Buffer(mg2+)、1mg/mL蛋白酶K，2×TaqPCRMasterMix（北京金百特生物技术有限公司）、50×TAE、核酸染料、DL2000DNAMarker。4.2引物引物序列见GB/T29577附录C。5仪器和材料5.1仪器土壤取样器（内径≤2cm），普通天平（感量0.01g），高压灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱，4℃冰箱，医用冰箱（-20℃),超低温冰箱（-80℃),NikonEclipseNi-U正置荧光显微镜，移液器（2μL，10μL，100μL，200μL，1000μL），制冰机，涡旋振荡仪，PCR仪，电泳仪、凝胶成像系统。5.2材料三角瓶（250mL），量筒（50mL），培养皿（90mm)，漏斗，离心管（1.5mL，2mL，50mL），PCR管（200μL），吸头（10μL，200μL，1000μL），接种针，载破片，盖玻片，打孔器，蜡烛。6样品采集及分离6.1样品采集土壤样品采集方法采用NY/T1121.1。取样时应使用内径≤2cm的土壤取样器，取样深度为15cm~20cm，“W”型取样15点～20点，每份土样重量以500g~1000g为宜。马铃薯样品采集方法：从马铃薯自然发病田块收集有腐烂茎线虫病症的马铃薯薯块，表型为干腐或湿腐，表皮皱缩。将样品放入自封袋，在4℃冰箱保存，一般在1个月内完成分离。6.2样品处理6.2.1线虫分离采用改进贝尔曼漏斗法进行分离，见SN/T1132-2002中附录B。6.2.2显微镜镜检将分离得到的线虫置于显微镜观察，明确是否有线虫。于65℃水浴锅中处理3min，热杀死线虫后，用4%甲醛进行固定，制成玻片，显微镜下观察是否为马铃薯腐烂茎线虫。7室内培养扩繁7.1不同真菌对马铃薯腐烂茎线虫的培养3使用PDA培养基纯化立枯丝核菌、炭疽菌和茄镰刀菌等6种真菌，待生长7d后，将1000条马铃薯腐烂茎线虫接种到不同真菌PDA平板中，25℃暗培养30d，计数，选出腐烂茎线虫最佳培养方式。表1培养马铃薯腐烂茎线虫的六种真菌1Fusarium.solani2Alternariatenuis3Rhizoctoniasolani4Fusariumoxysporum56Fusariumequiseti77.2马铃薯薯块对腐烂茎线虫培养扩繁线虫悬浮液制备：将分离得到的线虫用0.5%次氯酸钠溶液消毒1min后，3000r/min离心2min,弃上清液；加入0.5%硫酸链霉素和0.5%青霉素的混合液中消毒10min，离心后弃上清液，用无菌水冲洗3次，线虫悬浮液（约1000条/mL），4℃保存备用。马铃薯薯块扩繁：将健康马铃薯薯块用流动水冲洗、去芽去泥，75%酒精表面消毒。用灭菌的打孔器在薯块中央打孔；每个孔内接入线虫约500条，将取下的薯块组织塞回原处，石蜡封口。接种后置于25℃培养箱中培养，40d后观察其侵染情况。8鉴定8.1形态学鉴定将分离得到的线虫置于65℃水浴锅中处理3min，热杀死线虫后，用4%甲醛进行固定，制成玻片。每个样品各选取20条雌雄虫进行测量，主要测量线虫体长（L）、体宽（W）、口针长度（Stylet）、尾长（tail）、线虫体长与最大体宽之比（a）、线虫体长与体前部至肠前端的距离之比（b）、线虫体长与其尾长比（c）、体前端至阴门的距离×100/体长（V）。8.2分子鉴定DNA提取：将线虫放入ddH2O清洗，挑取单条放入200μLPCR管中（含8μLddH2O和1μL10×PCRBuffer液氮中放置1min，85℃加热2min，向PCR管中加入1μL1mg/mL蛋白酶K，56℃加热15min，95℃加热10min，得到DNA提取液，-20℃保存。以DNA为模板，进行PCR反应，反应体系见表2。表2PCR反应体系（20μL）2×TaqPCRMasterMix4腐烂茎线虫PCR反应体系如表2所示。反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min共30个循环；72℃5min，4℃保存。9样品保存与处理9.1土壤样品的保存与处理对检出马铃薯腐烂茎线