层析分离纯化技术

层析分离纯化技术内容提要1、层析原理与操作2、蛋白质纯化策略

生命科学与生物技术生物分离技术基因重组技术免疫检测技术从基因组到蛋白质从有限到无限离心沉淀电泳层析层析原理与操作

层析的起源和原理起源1906年，俄国植物学家Tsweet原理利用物质分配系数不同达到分离目的原理与操作Chromatography层析色谱什么是生物层析

根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离

极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP

离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX

大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF

结构特征与活性位点：shape(ligandbinding,affinity)AC

这些特性的区别使不同分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离原理与操作层析技术

IonExchange(IEX)－离子交换电荷–可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化SizeExclusion(SEC)－分子筛（或凝胶过滤）分子大小–用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化Affinity(AC)－亲和生物相互作用

–用于复杂样品的最早捕获或中间纯化HydrophobicInteraction(HIC和RP)－疏水和反相疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖CeramicHydroxyapatite(CHT)&CeramicFluoroapatite(CFT)－羟基磷灰石独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化原理与操作液相层析

最广泛的蛋白质分离纯化方法

条件温和

维持蛋白质空间结构与活性

基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离

蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离原理与操作层析的5个操作步骤装柱并平衡上样平衡洗脱再生上样装填有层析介质的层析柱分离分离组分流出原理与操作层析图原理与操作第一峰,外水体积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质VoVeVt蛋白质含量(A280),由UV检测器读出，y轴基线洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉有时这里也显示梯度浓度等检测值时间或体积，x轴DuoFLow软件系统非常直观，易学简单明快，4个步骤进入操作：

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观察样品情况,调节色普图和峰高度

orGoDoSomethingElse!快速启动功能：2次击键进入操作

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–EnterUserandMethodNameDuoFLow软件系统Setup–selecthardwareDuoFLow软件系统Protocol–entermethodDuoFLow软件系统PostRunOptions-Activity

DuoFLow软件系统PostRunOptions–PeakTaggingDuoFLow软件系统PostRunOptions–TRACECOMPARE层析图比较

单一柱子单一程序走不同样品单一样品和单一程序走不同柱子同一样品和柱子走不同程序DuoFLow软件系统DuoFLow软件系统DuoFLow软件系统纯化平台的硬件结构——

层析介质与层析柱，原理与技术层析介质离子交换层析介质

UnosphereQ，S

MacroPrepHighQ,HighS,DEAE,CM亲和层析

ProfinityIMAC金属螯合介质

Profinity

Epoxide环氧亲和介质

Affi-GelProteinA,

Affi-PrepProteinA

Affi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶

Affi-Prep多粘菌素介质

Affi-Gel硼胶

Affi-Gel配体固定化活化介质凝胶过滤层析介质

Bio-GelP系列

Bio-BeadsS-X介质羟基磷灰石介质（CHT）氟代羟基磷灰石介质（CFT）疏水层析介质

Macro-PrepMethylHICMacro-Prept-ButylHICBio-BeadsSM-2吸附剂层析柱分析柱离子交换分析柱：UnoQ,S

Aminex分析柱——分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分子羟基磷灰石分析柱：Bio-ScaleCHT-I

凝胶过滤分析柱：Bio-Sil,Bio-SilectHPLC分析柱反相层析分析柱：Hi-PoreRP304,Hi-PoreRP318各种层析介质的Cartridges——用于条件摸索

MacroPrepCHTHICBio-ScaleMiniCartridgesUNOColumn层析介质结构原理UnosphereMacroPrep离子交换层析Q，S，DEAE，CM疏水层析-CH3,t-Butyl亲和层析ProteinAIDA－Ni多粘菌素凝胶过滤CHT和CFTUnosphereQ,SMacroPrepHighQ,SMacroPrepDEAE,CMMacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHICProfinityIMACProfinity

EpoxideAffi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel,DEAE,CMAffi-PrepPolymixinAffi-Gel硼胶Affi-Gel配体固定化活化层析介质及其技术凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析凝胶过滤层析分离纯化原理1001,00010,000100,000Bio-GelP2Bio-GelP4Bio-GelP6Bio-GelP10Bio-GelP30Bio-GelP60Bio-GelP1001,8008004,0001,0006,000，用于脱盐1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝胶过滤层析凝胶的选择柱长的选择

分离：80－120cm

脱盐：30cm以下

洗脱液

离子强度低高离子作用排阻作用（0.05-0.2M)疏水作用pH——中性流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量：1－3％CV凝胶过滤层析操作参数选择1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质

具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/302.脱盐凝胶过滤层析凝胶过滤层析的应用cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQQuaternaryamineCMCarboxy-methylSSulfonate离子交换层析离子交换层析类型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-pIstabilityrangestabilityrange与阳离子交换介质结合+-denaturationdenaturationpH102离子交换层析离子交换层析原理——蛋白质滴定曲线蛋白质净电荷与阴离子交换介质结合Products:UNOsphere™Q&S,Macro-Prep®HighQ&S,CM,DEAE,AG®resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration--++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++-----++++++++++++++++++++++++++++++------------++++++++++++++++++++++++++++++离子交换层析离子交换层析原理离子强度洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.

在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。缓冲液与pH

选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)

缓冲液PH值：阳离子低于pI一个pH单位以上阴离子通常高于pI一个pH单位以上

蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。离子交换层析离子交换层析操作参数选择pI＝5.5+-pH102离子交换层析缓冲液与pHpI＝7.5阳离子交换阴离子交换碱性蛋白，采用阳离子交换酸性蛋白，采用阴离子交换蛋白质净电荷pH4.0pH9.0蛋白质稳定性范围Columns

MediaBio-ScaleQ Macro-PrephighQBio-ScaleDEAE Macro-PrepDEAEBio-ScaleS Macro-PrephighSBio-ScaleCM Macro-PrepCM Macro-Prep25Q Macro-Prep25DEAE Macro-Prep25SUNOQ UNOsphereQUNOS UNOsphereS离子交换层析离子交换层析产品50um25um120um80um10um更高的选择性和分辨率10%穿透载量:UnosphereQ:>150mg/mlBSA@600cm/hrUnosphereS:>30mg/mlBIgG@600cm/hr高流速，低反压

－操作压力:<2bar@1200cm/hrwith20cm更高的碱稳定性短期:1.0MNaOH@RTfor>1week长期:Storagein0.1MNaOH@RTfor>1year生产效率大大提高离子交换层析UNOsphereQ/S性能参数Ca2+PO3-4CrystalFormationCrystalDryingAndGranulationSinteringAtHighTemperature羟基磷灰石（CHT）合成Ca10(PO4)6(OH)25个带正电荷的Ca离子对（C位点）2个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点）2个羟基于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面CHT陶瓷羟基磷灰石晶体结构羟基磷灰石（CHT）羟基磷灰石（CHT）产品类型与参数蛋白质带正电氨基经典的阳离子交换用中性盐溶液

(NaCl)或缓冲盐溶液

(PO4)洗脱羟基磷灰石（CHT）初级保留机制带负电羧基经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节比离子间静电相互作用强15–60倍在无PO4

条件下不能被任何浓度NaCl洗脱用PO4洗脱初级保留机制羟基磷灰石（CHT）大部分大分子蛋白质以两种保留机制联合模式结合：Ca亲和与阳离子交换酸性蛋白质的结合，如白蛋白（albumin）以钙亲和作用为主，阳离子交换仅有轻微的作用，这意味着NaCl对白蛋白载量和保留的影响是非常有限的。碱性蛋白质，如IgG以阳离子交换作用为主，其载量和保留受NaCl影响显著注：对于带负电荷的酸性蛋白质，无论样品是否含有NaCl，都对上样时的吸附载量和保留无影响，这意味着可以将捕获阶段获得的中间体样品无需脱盐处理即可上样到CHT上进行高分辨率中间纯化羟基磷灰石（CHT）混合保留机制TypeI由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.TypeII由于具有大孔结构，II型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备如何选择类型羟基磷灰石（CHT）分离纯化原理与操作参数选择羟基磷灰石（CHT）影响蛋白质色谱行为的操作参数：

CHT类型

NaCl浓度

PB缓冲液浓度梯度双梯度洗脱

PB缓冲液梯度含不同NaCl浓度缓冲液pH值双梯度洗脱模型先以0-500mMNaCl，再以0-500mM磷酸钾不同类型CHT陶瓷羟基磷灰石在不同pH下不同蛋白质的保留时间（min）羟基磷灰石（CHT）基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合不同离子的疏水性Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱原理疏水层析MacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHIC产品操作参数选择疏水层析疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水

疏水性强的蛋白质：甲基，丁基疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基盐：硫酸铵，醋酸铵等等缓冲体系和pH洗脱梯度DefinitionSeparationofproteinsbasedonreversibleinteractionsbetweenaproteinandaspecificligandcoupledtothestationaryphaseAffinityChromatography

PrincipleProfinityIMAC——纯化His-taggedProteinChelex100——纯化DNA，PCR样品制备Affi-GelProteinA——纯化单克隆抗体Dye-Affi-GelBlue(DEAEorCM)

——纯化单抗，分离HSAAffi-Gel肝素凝胶——多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶Affi-GelPolymixin——去除内毒素（热原）Affi-Gel硼胶——分离核苷酸、核苷、儿茶酚胺、糖类等小分子亲和层析产品与应用ProfinityIMACResins固定化金属螯合层析：ImmobilizedMetalAffinityChromatography（IMAC）

基于纯化重组组氨酸标记蛋白设计，专门纯化His-taggedProtein

螯合带电离子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+,现有的产品为螯合Ni2+的介质

UNOsphere

技术

更好的流动特性，在高流速下载量，目的蛋白得率和纯度不会受到影响。IDACartridgesBio-ScaleMiniCartridges

ProfinityIMACNi金属螯合——纯化His-Tagged重组蛋白质

GST-Tagged重组蛋白质柱:1ml和5ml两种规格

ProteinA抗体亲和柱

Affi-GelBlueGel蓝胶

DEAE蓝胶预装柱：用于纯化抗体，5ml规格

Bio-GelP-6脱盐柱：5ml、10ml和50ml三种规格

UNOsphereQ/S强阴/阳离子交换：1ml和5ml两种规格

DEAE弱阴离子交换：1ml和5ml两种规格

CHT-I和II型预装柱（即将上市）HPLC分析柱Aminex分析柱专业用于分析单糖、糖醇、寡糖、有机酸、以及肽和核酸等有机小分子独特的混合分离机理：涉及离子排阻、离子交换、配基置换、分子排阻、反相和正相等各种分离机理的作用。可分离各种单糖、糖醇、寡糖、有机酸以及小肽和氨基酸等等物质。应用范围包括林学研究、酶学研究、各种发酵以及发酵液分析与质控，医药中间体质控等等分离纯化的目的以最简单的技术最少的步骤，最高的收率，最低的成本，生产合格产品。蛋白质纯化策略样品准备捕获中间纯化精纯故事刚刚开始…层析的目标

目标

纯度，Purity(>90%vs.≥99.9%)

活性，Activity(activevs.inactive)

含量，Quantity(ngormglevels)

关键杂质的对数减少，Logreductionsofkeycontaminants

必须了解的蛋白特性分子量与等电点

pH、温度稳定性，pH,tempstability

盐、去污剂、有机溶剂和金属离子的影响

Effectsofsalt,detergents,organicsolvents,metalions

后转录修饰，Post-translationalmodifications

选择层析类型

变性/非变性，Denaturing/non-denaturing

分辨率，Resolution

得率，Yield

速度，Speed

BeforeStarting…蛋白质纯化策略ProteinPropertiesDetermineBestResinMolecularBiologyofTheCell,3rdEd.,Albertsetal-+His6IMACNi++,Co++ProteinACibacronBlueF3GA-OCH3HIC-OCH(CH3)3CHTCa++,PO4--QResins-N+(CH3)3SResins-SO3-CMResins-CH2COO-SEC(GF)DEAE-N+H(CH2CH3)2工艺策略样品准备技术手段：离心，沉淀（硫酸铵、等电点、有机溶剂），过滤，超滤包涵体表达的样品：菌液分离，包涵体提取和清洗，包涵体溶解，复性细胞周质表达的样品：菌液分离，反渗透破菌，沉淀和超滤分离细胞和酵母等真核分泌表达的样品：菌液分离，超滤或直接捕获纯化天然生物材料样品纯化未知蛋白质：不同来源样品处理方法不同：

各种微生物发酵液和细胞培养液、动物天然样品（蛇毒、蟾毒、昆虫）、植物天然样品等等工艺策略重组蛋白质样品分析表达丰度胞内，胞外表达量：样品纯度×样品蛋白质浓度×样品体积主要杂蛋白：白蛋白，血清蛋白，培养基蛋白，胞内各种杂蛋白，内毒素等等包涵体菌液分离，破菌，提取，含量和纯度分析洗涤：1%的中性去垢剂，如Tween、TritonX-100等，加EDTA和还原剂2-巯基苏糖（DTT）、β-巯基乙醇等等，低浓度盐酸胍或尿素捕获:

快速去除关键杂质，例如能降解目标蛋白的组分，如蛋白酶等，浓缩样品，去除高峰度杂质蛋白中间纯化:

去除大部分残留的杂质蛋白精细纯化：

去除与目标蛋白性质接近的残留少量或微量杂质蛋白工艺策略工艺策略菌液分离，澄清脱盐捕获中间纯化精纯浓缩离子交换亲和CHT羟基磷灰石疏水亲和离子交换凝胶过滤（分子筛）亲和HPLC80－120um40－80um10－50um层析介质颗粒大小各步骤的评价参数

纯度得率生物活性工艺时间载量流速分辨率得率工艺策略各步骤的评价方法

电泳：SDS，PAGE

蛋白质浓度测定生物活性测定

HPLC分析IEXCHTIEXAffinitySECAmmoniumsulfateHICCHTAffinitySECAffinityCHTIEXSEC工艺路线选择1、IEX——IEXMacro-PrepHighQ和HighS两步纯化IgMFEA

BCD

GH0.5-0.4-0.3-0.2-0.1-0.0-

||||||

|

0.0

2.5

5.07.510.012.515.0

litersAU(2mm)cond.A280DA

B

CFGE0.20-0.15-0.10-0.05-0.00-

|

|

|

|

|

|

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

litersAU(2mm)cond.A280HighS的初纯HighQ的精纯工艺路线选择200116

97

66

55

36

31

22

14

61

2

3

4

5

6

7

8

9

10kDaLane Sample 1 MWStandard 2 Bioreactorsup(reduced) 3 Bufferexchangedmaterial(reduced) 4 PartiallypurifiedIgMfromcationstep(reduced) 5 HighlypurifiedIgMfromanionstep(reduced) 6 MWStandard 7 Bioreactorsup(non-reduced) 8 Bufferexchangedmaterial(non-reduced)

9 PartiallypurifiedIgMfromcationstep(non-reduced) 10 HighlypurifiedIgMfromanionstep(non-reduced)1、IEX——IEXMacro-PrepHighQ和HighS两步纯化IgM工艺路线选择2、IEX——CHTUNOsphereS和CHT羟基磷灰石两步纯化鼠mAb

IgG工艺路线选择UNOsphereS初纯CMUNOspherePACHTCHT2、IEX——CHTUNOsphereS和CHT羟基磷灰石两步纯化鼠mAb

IgG工艺路线选择CHT精纯3、Affinity——IEX——CHT纯化mAb工艺路线选择原理ProteinAtoremovethebulkof