系统的分析与分离台湾地区犬瘟热病毒

系统的分析与分离台湾地区犬瘟热病毒摘要于2003-2005年间自17支未经疫苗注射之发病幼犬，应用患犬血液单核球与B95a细胞株共同培养之技术，分离出两株可以诱发融合细胞病变的病毒，经免疫荧光染色及抗原测试确认为犬瘟热病毒。将此两株病毒之血球凝集素基因（H），与同期间自台湾大学动物医院临床送检病例之另外4株犬瘟热病毒之H基因进行核酸定序。经比对序列与树状图分析发现，本土病毒株皆有9个N连接配醣位，其中第7个配醣位为日本或中国大陆流行之亚洲1型犬瘟热病毒所特有。本研究显示台湾地区所流行之犬瘟热病毒，经其H基因分析属亚洲1型。关键词:犬瘟热病毒，H基因，台湾简介犬瘟热（CD）最早发现于1791年的西班牙，1905年卡尔（Carre）首次将犬瘟热病毒（CDV）分离出来。这种传染病的病原机理及临床特征已经被广泛报道。自最初被认证之后的200多年来，虽然犬瘟热病毒也感染野生食肉动物及大型猫科动物，但是最多发现的病例还是在狗类之中。犬瘟热病毒是属于副粘病毒科麻疹病毒属的负链线性RNA病毒，基因组全长15690个核苷酸。一个基因组含六种主要编码蛋白，其中一个基质膜蛋白（M），两个糖蛋白（附着或血凝素蛋白H和融合蛋白F），两个转录酶活性蛋白（磷蛋白P和大蛋白L）和一个核衣壳蛋白（N），由核衣壳蛋白N包裹前五种蛋白共同编码成一条RNA病毒链。通过注射弱毒疫苗可以防止犬瘟热病毒的感染。然而，由于母体对病毒疫苗的干扰作用，虽然已经注射过疫苗，但处于郊区的幼犬和市区宠物商店里的发病率一直在上升，这种情况在日本尤为显著。据推测这种抗原变化就是现在CDV流行的原因，而非疫苗已经无法很好地起到保护作用。尽管已经在台湾报道过相似的问题，但是由于分离野生型CDV和区域型CDV的困难导致无法分析研究区域流行性CDV的特征。而由于抗原变化大多发生在H蛋白上，因此有人指出对CDV病毒的基因突变的研究应集中于这个蛋白质上。许多细胞株已经经过测试培养野生型CDV和保持其同种性和毒性的能力。其中，用绒猴B淋巴细胞系（B95a）培养的细胞群是极易被感染的宿主。通过这项研究，我们已经运用患犬血液单核球与B95a细胞株共同培养之技术成功分离出两个台湾区域的CDV，从患病犬身上提取出四个犬瘟热病毒基因H以及六株通过与其他分离出的标本对比核酸顺序之H基因后的细胞株。材料和方法动物17只动物收容所的不足三四月大的未感染的幼犬，以及440只由台湾国立大学提供的已临床诊断疑似感染CDV病毒的狗。在440个临床病例里，被P基因RT-PCR标注出的阳性诊断病例有166例，占37.7%。在2003年10月到2005年12月期间，从这些阳性病例中，挑选出四分之一的样本做进一步的H基因分析。这166只狗全部显示出感染CDV的迹象，且表现出至少一种症状，例如中央神经系统方面的迹象有抓咬，运动失调，原地打转和肌阵挛；消化系统方面的迹象有腹泻，呕吐，无精打采和厌食；呼吸系统方面的迹象有鼻腔及眼黏分泌物，咳嗽，呼吸困难和打喷嚏。细胞培养及病毒分离B95a细胞株在中号RPMI1640中增殖（Gibco,GrandIsland,NY,USA）,培养基中还添加有2%或10%经过高温杀菌的牛胎儿血清（FBS）（Gibco,GrandIsland,NY,USA）和2mM谷氨酸盐，1.5g/L碳酸氢钠，4.5g/L葡萄糖，10mMHepes和1mM丙酮酸钠，放置于含5%CO2浓度的空气中培养。将从外周血白细胞分离出的病毒株（PBML）隔离在淋巴细胞分离液里，用与Blixenkrone-Moller提过的相似方法处理。简而言之，用三到五毫升肝素加固的从17只疑似感染CDV的幼犬血液在加了2%高温杀菌的FBS的RPML1640培养基中稀释为1:1的比例。用1.077g/mL,400g的聚蔗糖密度梯度离心手法在室温下处理45分钟分离出PBML。将表层细胞株取下，并在含2%FBS的RPMO1640培养基中用400g，3分钟的离心法洗两次。之后覆盖在25cm2烧瓶中培养的50%到60%的B95a细胞株上，观察2到3天其细胞病变效应。当B95a细胞中100%融合后且检测不到CPE时，就开始第二阶段的盲传。即用细胞刮刀（细胞刮刀353085，FalconBectonDickinsonLabware,FranklinLakes,NJ,USA）移除融合的B95a细胞株。将1mL刮出的融合细胞中悬浮于25cm2纯50%融合B95a细胞株培养烧瓶共下一阶段的盲传和测试。CDV抗原检测当感染的B95a细胞株显示出40%到50%的CPE时，将细胞刮出并滴四滴悬浮液分布于BIT极速上色的CDV样本周期带上。BIT极速上色CDV工具（Donghwa-Ri,Bongdam-Eup,Hwaseong,KyungGi-Do,Korea）用于测试CDV抗原的存在。简而言之，从感染体身上提取出的全部血液（血清或血浆），眼膜或鼻膜分泌物溶液都分布于样本周期带中。等待5到10分钟后用肉眼看结果。主控线上（C）显示出一个红色或紫色色带，测试线（T）上无明显色带的则表明为CDV感染的阴性结果。主控线上（C）显示一个红色或紫色色带，测试线上（T）显示色带的则表明阳性结果。间接免疫荧光测定当感染的B95a细胞株在25cm2烧瓶中显示出40-50%的CPE时，将细胞株取出并铺开在10周期的免疫荧光测定（IFA）片上（Assistant-Prazisions,Glaswarendabrik,KarlHechtKG,Sondheim,Germany）。测定片是经空气干燥，并在4°C下经丙酮甲醇1:1处理15分钟。在处理的细胞中用IFA（OlympusBX51,Shinjku-Ku,Tokyo,Japan）显微检测病毒抗原。原始抗体，即一个老鼠抗CDV血型稀释于1:150的抗原稀释液中（VentanaMedicalSystem,Tucson,AZ,HSA）,然后敷在细胞株上在37°C温度下60分钟。之后将细胞株注入磷酸盐缓冲盐水（PBS;DakoCytomation,Carpinteria,CA,USA）中停10分钟，再用FITC标记的第二抗原山羊抗鼠免疫球蛋白（Chemicon5008,SingleOakDriveTemecula,扁桃体和脾脏中分离出的CDV有一点低。现在对于CDV的H基因的分子数据的广泛认知已经允许关于地理起源，6种明显的动植物种类史的分化的认定。在一个给予考虑的地理范围，两到三种CDV的基因型可以表现出来。基于H基因的进化分析，六个台湾菌株在这次研究中被讨论，包括NTU1-2004，NTU4-2003，NTU3-2004,NTU2004，NTU2005-1，和NTU2005-2。这些菌株属于Asia-1群组，与过去的CDV和Asia-2群组有明显区别。本研究中经鉴定的六种CDV菌株间联系紧密。这也许是由于所有的样本在一个限定的时期（2003-2005）都来自台湾北部。然而，在动植物种类树同一分支的菌株显示着在H基因上大于95%的氨基酸相似性，因此会被认为属于同一基因型。第8137个在病毒基因组的核苷酸，疫苗的一个胸腺嘧啶，在野生型菌株中被取代为胞嘧啶。这个点突变也在这次研究的六个台湾菌株中发生。使用EcoRV和SsoⅠ进行H基因的RFLP分析也许对检测台湾菌株有用处。这次研究中的地区CDV菌株拥有9个天冬酰胺，这九个天冬酰胺是N连接糖基化在他们