3.2基因工程的基本操作程序第2课时高二下学期生物人教版选择性必修三

3.2基因工程的基本操作程序【补充】基因的结构DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遗传效应的DNA片段能编码特定的蛋白质编码区上游编码区下游能转录出mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质。不转录、不翻译不转录、不翻译非编码区：含有能调控遗传信息表达的DNA序列，如启动子、终止子启动子终止子获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？基因编码区获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用这就是需要构建基因表达载体。这也是培育转基因抗虫棉的核心工作1.构建基因表达载体的目的：2.基因表达载体的组成思考：要各个部分有什么作用？（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。（核心步骤）02目的基因：能控制表达所需要的特殊性状必须插到启动子和终止子之间复制原点：DNA复制的起始位点终止子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的下游功能：终止转录四环素抗性基因、荧光蛋白基因等启动子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA标记基因：鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞（如：已成功转化的受体细胞具有某种抗性基因，可在相应选择培养基中生长）02基因表达载体的构建

当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。诱导型启动子：普通的细菌一般是对抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四环素的培养基中______（能/不能）生长。如果给普通细菌导入一个含有四环素抗性基因的质粒，四环素抗性基因的____________可使细菌获得抵抗四环素的性状。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。敏感不能表达产物【思考】如何利用标记基因筛选呢？启动子终止子起始密码子终止密码子【区分两组概念】位于DNA上位于mRNA上启动翻译终止翻译启动转录终止转录(本身不转录)决定氨基酸不决定氨基酸对比启动子起始密码子终止子终止密码子所在位置DNAmRNADNAmRNA作用RNA聚合酶的结合位点，转录的起始点。翻译的起始点AUG(甲硫氨酸）GUG（缬氨酸）转录的终点翻译的终点（UAA、UGA、UAG)02基因表达载体的构建重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？基因表达载体3.构建基因表达载体的过程限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因限制酶重组DNA分子DNA连接酶启动子终止子质粒限制酶切割位点①用限制酶切割载体，使它出现一个切口；②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因；③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。目的基因与质粒载体缺口的末端相同，便于连接（重组质粒）3.构建基因表达载体的过程基因表达载体基因表达载体的构建（核心步骤）02基因表达载体重组DNA分子目的基因DNA限制酶限制酶DNA连接酶载体②能自我复制,或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因

④对受体细胞无毒载体应具备条件：限制酶切割位点标记基因复制原点载体的种类：质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒目的基因DNA限制酶切割位点标记基因复制原点质粒载体与基因表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。基因表达载体在载体基础上增加了目的基因。【问题探究】请结合下图，回答问题：（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？能会出现以下产物：①目的基因——载体连接物②载体——载体连接物③目的基因——目的基因连接物②③分别叫做载体的自身环化和目的基因的自身环化×活动一：用同一种限制酶切割目的基因和质粒，用DNA连接酶连接后会出现几种产物(只考虑两两结合)？

单酶切只用一种限制酶切割的时候可能会出现什么问题？质粒与目的基因反向连接单酶切缺点:质粒重新环化目的基因自身环化质粒与目的基因反向连接02基因表达载体的构建（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；②还可以防止目的基因与载体的反向连接。所以如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？双酶切（产生不同的黏性末端）用两种不同的限制酶同时对目的基因和载体进行切割【问题探究】请结合下图，回答问题：双酶切用两种不同的限制酶同时对目的基因和载体进行切割【实战】图解限制酶的选择原则（1）不破坏目的基因：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。（2）保留标记基因（至少保留1个完整的标记基因）、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。（3）确保载体和目的基因出现相同黏性末端：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；（4）为避免目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接到载体，可选用什么限制酶？可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。1.转化指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程，此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。2.将目的基因导入受体细胞的方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法03将目的基因导入受体细胞冠瘿瘤农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。（1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法②农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数____________没有侵染能力。双子叶植物裸子植物单子叶植物b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将___

___上的____

__（____________）转移到被侵染的细胞，并且将其________________________Ti质粒Ti质粒T-DNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA上将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。③利用农杆菌进行转化的思路：Ti质粒的T-DNA转化进入植物细胞（1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。载体：农杆菌Ti质粒（T-DNA)03阅读P81资料卡，完成以下填空：T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中？植物组织培养非人工操作非人工操作（1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法农杆菌转化法过程双子叶、裸子植物受损伤口分泌酚类物质和糖类物质吸引农杆菌向受伤组织集中将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。激活Vir区基因，导致T-DNA加工和转移（1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法农杆菌转化法过程(1)第一次拼接______________________________________________________________________(2)第二次拼接______________________________________________________________________(3)第一次导入_____________________________________________________________________(4)第二次导入____________________________________________________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）03将目的基因导入受体细胞据图回答问题：03将目的基因导入受体细胞第1次拼接第2次拼接第1次导入第2次导入该过程经过____次拼接、____次导入？1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？

得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养思考讨论：03将目的基因导入受体细胞转化的具体方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________。受体细胞为_______与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株体细胞b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得_______，再进行________、_________等。受体细胞为_______花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定受精卵（1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法①用______________将________________________直接注入_______中。微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定时间内，剪去______，将____________滴加在_________上，使目的基因借助________________进入_______。柱头DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受体细胞：受精卵子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊（1）将目的基因导入植物细胞--花粉管通道法我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法花粉管通道法是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。03将目的基因导入受体细胞②操作过程：为什么常选受精卵作为受体细胞呢？（2）将目的基因导入动物细胞--显微注射法①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）获得具有新性状的动物①受体细胞：受精卵拓展：【其他方法】科学家也用病毒DNA

与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如慢病毒载体、腺病毒载体等。（2）将目的基因导入动物细胞03选