生物等效性实验生物样品处理注意事项

生物等效性实验生物样品处理注意事项一、样品采集后的的处理和贮存鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。1.1血液样本处理注意事项1.1.1.在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质(含钾、钠、氯离子)的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血还可干扰某些化学项目(TBil、DBil、TC等)的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。引起溶血的原因有：注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。为避免溶血，取血时应注意：①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空；②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封；③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫；④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液；⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水；⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入；⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量；⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入；⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数；1.1.4.正确选择采集管。通常情况下多采用血清为样本(不抗凝)，部分检测项目需注意样本属性为血清或血浆，两者不可替代。一些特殊检验项目需要使用抗凝剂时，应注意选择合适的抗凝剂并注意抗凝剂与血液的比例，以防止样本凝血或红细胞形态的改变；抗凝血样本采集后立即轻轻摇匀至少上下颠倒8次，以防凝血发生。1.1.5.多项化验采血顺序：血培养瓶(厌氧瓶优先)→蓝帽管→黑帽管→红/黄帽管→绿帽管→紫帽管→灰帽管→其他。1.1.6需要冻存的全血按要求分装到统一规格的无菌冻存管中，加入DMSO混合均匀后将冻存管放入4℃冰箱中半小时，再放入-20℃冷冻冰箱中，至少4小时候后，才能转移到-80℃或更低温条件下储存。1.1.7抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去除杂质再进行检测。1.2尿液、粪便样本处理注意事项1.2.1尿液主要是水、尿素、盐类及少量小分子蛋白，是理想的细菌生长液，因此应在取样后立即测定。不能立即测定时，应于4℃冷藏，如在室温保存，则应在采样后的尿液中加入少量防腐剂甲苯（1%）或氯仿（饱和）。样本留取过程中应避免混有血、脓或阴道分泌物、粪便等可引起“假性蛋白尿”的成分。检测非蛋白类待测物时，可根据试剂盒需求进行蛋白沉降操作（离心/化学沉淀）。用于一些血液病的样本应注意在留尿前勿对动物进行酒精涂抹、吸入，注射巴比妥类、磺胺类、利眠宁、眠尔通、苯妥英钠等药物，样本应避光保存。1.2.2粪便样本应尽量使用新鲜样本，采集后立即送检。若样本久置，则会因pH及消化酶等因素而使粪便中生物成分分解破坏。样本中不可混有尿液，更不可采取浸泡于尿液中的粪便样本。样本中不可混入垫料、污水等，减少微生物和颗粒造成的影响。粪便样本不应用卫生纸包裹、手指抓取，应使用棉签，干净的镊子等夹取，直接装入蜡纸盒或EP管并密封，以防水分丢失。1.3骨髓样本处理及注意事项骨髓样本一般通过脊柱穿刺、股骨采取。采集的骨髓液收集于无菌肝素抗凝管内，取材环境应保持洁净（至少为SPF环境）。若骨髓标本含有红细胞，在冷冻前应先将其离心去除。骨髓标本采集后应尽快根据冻存程序并储存在-80℃环境下。1.4胃肠液样本处理及注意事项取材前应禁食12小时，在空腹状态下取材。取出胃肠组织时，应夹闭贲门和幽门，及肠道切口两端，避免肠液胃液流失/混入血液。需要灌洗肠胃时应注意灌洗液体积、回收率。肺泡灌洗液样本同上处理。1.5脏器样本处理及注意事项取材后应迅速将脏器称重，以免水分蒸发造成差异，特别是肾上腺等小器官的称重。脏器称重前应尽量将周围脂肪组织和结缔组织剔除，并用滤纸吸去脏器表面血液及体液，特别是肾上腺、甲状腺、前列腺等较小的器官，更要新鲜称重，防止器官干燥失水而重量减轻。空腔器官称重前，应清除其腔内液体，如心脏应除去血块。1.6组织匀浆样本处理及注意事项匀浆介质的制备一般采用pH7.4,0.01mol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化钠溶液或直接用0.86%的生理盐水作为匀浆介质。ELISA检测的匀浆介质可使用PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol的PBS。酶活性类检测则必须使用生理盐水。三、各类检测项目注意事项激素类：包括类固醇（肾上腺皮质素、性激素）、蛋白质和多肽类（垂体、下丘脑、胰腺）、脂肪酸衍生物（白细胞三烯、前列腺素）、氨基酸衍生物（肾上腺素、甲状腺素）。在室温条件下大致稳定性从高到低为：固醇类（数周至数天）→蛋白质和多肽（数周至数分钟）→氨基酸衍生物（数天至数分钟）→脂肪酸衍生物（数天至数秒）。检验按照检验项目的特性取材即刻检测，或是选择-70℃冻存，避免反复冻融，且避免水浴时间过长，建议冻融即开始检测（注意吹打混匀）。蛋白类：包括酶、抗体、表面标示蛋白、总蛋白组织液、泛素、部分激素类等。在-70℃中相对保存时间较长，但反复冻融极易破坏稳定性，水浴更容易被细菌或样本内自身的酶降解。其中抗体类蛋白最为稳定，IgG甚至能在血清中4℃稳定保存23天。而酶类在血清中4℃放置8小时即会造成活性下降。血清蛋白则能在24小时内保持稳定。多肽类：根据分子量大小，较长的肽链稳定性能与蛋白相当，分子量越小则稳定性越差，血清样本建议24小时内检测处理，-70℃冻存时应避免反复冻融。氨基酸：在中性条件下可在-70℃至-20℃冻存数月，但4℃以上开始，血清样本中氨基酸会缓慢被酶代谢，在酶类丰富的组织液和细胞裂解液中更容易代谢。建议加快冻融复温后的检验进程。生化类检测项目：这些检验项目较为复杂，除了部分有机盐类之外，大部分易受氧化、光照分解、生物降解。考虑到实验室方法学允许误差，参考检验科对具体项目的测定要求：GLU应在4

h内测定，BUN（尿素氮）、TBIL（总胆红素）应在8

h内完成，TP（总蛋白）、ALB（白蛋白）、ALT（丙谷氨酸转移酶）、AST（天门冬氨酸转移酶）、ALP（碱性磷酸酶）、GGT（GGT谷氨酰基转移酶）、Ca2+、PT应在24

h内测定完。血液标本长时间放置后，其结果偏高的是：TP、ALB、ALT、AST、ALP、GGT、Ca2+；其结果偏低的是：BUN、TBIL；对结果影响差异无显著性的是：TG（甘油三酯）、DBIL（直接胆红素）。这提示，要得到血脂等指标的可靠准确的检测结果，标本也不适宜在低温下长时间保存。正是由于血液放置时间对有些生化检验项目的影响，对于工作量大的生化室应先测定不宜长时间放置的标本，而不能及时测定的项目应把血清分离出来后放置2-8