哺乳仔猪皮炎与肾病综合症与坏死杆菌病混合感染的实验室诊治

1/1哺乳仔猪皮炎与肾病综合症与坏死杆菌病混合感染的实验室诊治哺乳仔猪皮炎与肾病综合症与坏死杆菌病混合感染的实验室诊治前言PCV-2主要感染8-13周龄的猪，其特征为体质下降、消瘦、腹泻、呼吸困难，多表现为PMWS。

PCV常与猪细小病毒（PPV）或猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）混合感染，从而使疾病更趋于复杂化和多样化。

猪圆环病毒病是指以2-型圆环病毒为主要病原、单独或继发/混合感染其它致病微生物的一系列疾病的总称。

其主要发病类型有猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、先天性震颤、肠炎等一些临床症状。

本病最早发生于加拿大（1991），此后很快在世界各地（大洋洲除外）流行，近年来亚洲及我国各地有关的报道也越来越多。

朗洪武（2000，2001），曹胜波（2001）先后通过血清学方法和PCR技术在河北、北京、天津、山东、吉林、江苏、上海、河南、湖北和广东、广西检测到了PCV-2。

中国农业大学杨汉春教授等对北京、天津、广东、山西等12个大规模猪场病原检测和流行病学调查后发现11个猪场存在PMWS的感染，一个猪场存在PDNS的问题，由此可见PCV-2在我国的普遍性。

此病病原体是2-型圆环病毒，圆环病毒有两个血清型，1-型没有致病性。

发病逐渐增多的原因主要是2-型圆环病毒，无论是多系统衰竭综合征、呼吸道疾病综合征还是其它的复合感染，其病原均有病毒、细菌等多种致病微生物引起。

抗生素对大多数细菌、支原体、原虫都有疗效，只要能查清继发感染的病原种类、选用敏感药物，就能有效降低发病严重程度，减少死亡率。

但是由于病毒往往是原发性致病因素，抗生素对病毒无效。

所以抗生素的疗效并不理想，一旦停药，往往复发。

皮炎肾病综合症(PDNS)也是目前遇到的主要疾病问题。

PMWS似乎比PDNS出现的要早。

但后来知道PDNS于1993年就已经出现了，甚至更早。

PCV2分布极为广泛，在健康猪及病猪体内都能发现。

发病率一般在30～50﹪，且生长不良，如无严重并发症死亡率在10～20﹪。

PCV-2感染可以造成严重的免疫抑制，从而引起混合感染或继发感染。

PMWS和PDNS发生的原因目前还不十分清楚，然而研究表明，这是一种传染因子，2型环状病毒在两种病的发生中都起着重要作用。

已发现环状病毒有两个类型：

环状病毒1型(PCV1)首次确认于1974年，为非致病性病毒。

PVC2是于1997年在PMWS病例的病料中确认的。

该病毒也在其它病例中检出过，包括PDNS、先天性震颤、胎儿心肌炎以及增生坏死性肺炎等。

PCV2是一个很小(17nm)又很坚硬的病毒，它对高热和多数消毒剂的抵抗力很强。

研究表明，该病毒只是偶然引发PMWS，但没有该病毒就不会造成PMWS。

PCV2存在及其广泛，在多数健康猪群以及所有发病的猪群中都能检测到该病毒的循环抗体。

这种现象可表明：

病毒能够发生增殖，但病毒的存在并不一定能引发具有可见临床症状的疾病。

尽管实验研究证实单独PCV2可以引起轻微的疾病症状，并且当有其它病毒混合感染或免疫系统受到应激时，发病的机率及其严重程度就会明显增加，表明该病的发生通常有诱发因素。

目前对PCV2主要了解以下几点：

（1）PCV2在大多数猪群中存在。

因为几乎所有的猪场都能检测到一些猪体内有抗体。

（2）大多数消毒药都很难杀死该病毒，然而病毒对火碱和Virkon则很敏感。

病毒的抗体自从1974年就在一些猪群中存在。

（3）单独PCV2存在时很少引发疾病。

（4）病毒的抗体自从1974年就在一些猪群中存在。

（5）对病毒的传播方式了解的还不是很多，但病毒似乎很容易被传播，通过对病例的观察，病毒可能有多种传播形式。

如机械性转移：

靴子上的粪污、车辆、设备、鸟类、鼠类等；通过精液排泄病毒大约可持续6周，因此，理论上推测，病毒可通过人工授精或自然交配而传播，但目前尚未证实；感染后的带毒猪带毒时间可持续5-6个月，并通过鼻腔、粪便及精液向外排泄，因此最可能的传播方式是通过猪与猪间的接触。

关于PDNS的临床症状，最明显的是皮肤红色或棕色的病灶。

兽医发现这类病变时需要有心里准备，因为它的外表病变与猪瘟的病变非常相似，因此要立即报告到当地官方兽医机构进行鉴别诊断。

对于此病的诊断，主要是听取兽医的意见。

断奶猪与生长猪皮下有圆形的红色或棕色的出血病斑。

这些病变常见于耳、脸、腹侧、腿及臀部，通常感染10-16周龄的猪只，但有时5-24周龄的猪也受到感染，体况良好的猪常受到感染。

有的猪皮肤出现病变后突然死亡，而有些猪先消瘦然后死亡。

PDNS的发病率并不是很高，一般低于5%，但死亡率可大于50%。

对于PMWS和PDNS发生的原因目前还不十分清楚，然而研究表明，这是一种传染因子，2型环状病毒在两种病的发生中都起着重要作用。

本病主要是依据临床症状和剖检变化进行诊断，因为多数病例其皮肤病变具有特征性，然而，最近研究表明PDNS中会有某些巴氏杆菌和PCV2的混合感染。

10-16周龄的猪最易受到感染，5-24周龄的猪也可发病，受感染的猪体况均较好。

此病的一些常见剖检病变有:可见到皮肤有暗红或棕色的出血病变；肾脏色淡并有出血性病变；出血性病变也见于肺脏、大肠和小肠；淋巴器官出血、肿大；胃溃疡。

通过实验室检测可发现组织病理学--淋巴结中淋巴样组织减少，还可见到肾炎以及皮肤血管和淋巴腺发炎。

有许多疾病与PMWS和PDNS相似，所以这就是要征询兽医意见的原因，这些病包括猪瘟和其它一些常见疾病，如：

营养不良或饥饿、兰耳病、气喘病、断奶后瘦弱和绒毛萎缩(吸收不良)、腹泻(伤寒、大肠杆菌、轮状病毒、传染性胃肠炎)巴氏杆菌感染、副嗜血杆菌病、回肠炎、古典及非洲猪瘟等。

猪场发生PCV2后的严重与否似乎与猪场存在的感染因子的水平有关。

连续性使用的猪(场)舍对免疫系统是一个严重的应激，这种应激是一种关键因素，这种因素可促使PCV2去侵害淋巴系统而发生疾病。

另外营养在保障猪群健康方面是不容质疑的，特别是抗氧化剂的作用不容忽视。

本病的流行病方面有以下几个特点：

目前已知的诱发因素包括与兰耳病病毒、细小病毒、疫苗中的某些佐剂、猪场中已经存在的某些病原微生物的密切接触以及不良的饲养管理；PCV2能在多数健康猪群中以及所有的发病猪群中发现；营养缺乏或营养不良的诱因；某些品种可能更易感；存在着当免疫系统受到刺激时，PCV2致病性增强的可能性；一般来讲猪场健康状况越好，得病后的症状越轻；疾病的发生与没有或对PCV2的抗体较低有关，而有较高抗体的猪则不感染此病；在英国，当本病进入到一个未感染的猪场时，似乎是一种新的病源；诱发因素至关重要，它们能使PCV2进入到淋巴组织和免疫系统，并引发疾病；在美国，尽管也存在着繁殖问题，但该病并未在母猪群和哺乳仔猪中见到；PCV2对大多数消毒剂不敏感，病毒能在环境中存活几个月；一旦猪场存在该病，在场内可持续4个月或至少18个月或时间更长；疾病始发于3周龄的仔猪，之后于4-6周变得明显；仔猪在母体内或出生时可以受到感染；在受到PCV2感染的猪场，达到95kg体重时，几乎100%的猪有PCV2抗体；一些研究表明，某些母猪所生仔猪易受到感染，而另些母猪所生仔猪则不被感染，说明母猪个体或母猪日龄有一定影响。

坏死梭杆菌可引起仔猪的皮炎，是坏死杆菌病的一种临床症状。

坏死杆菌病由坏死梭杆菌引起各种哺乳动物和禽类的一种慢性传染病。

病的特征是在受损伤的皮肤和皮下组织、消化道粘膜发生组织坏死，有的在内脏形成转移性坏死灶，一般散发，有的表现地方流行性。

本病广泛发生于世界各地，在我国也有猪、牛、马、绵羊和鹿发病的报道，在南方耕牛、奶牛较为严重，是其主要传染病。

其病原坏死梭杆菌为多形性的革兰氏阴性菌，小者呈球杆状或段杆状，大者呈长丝状尤为在病变组织或培养物中。

幼龄培养菌着色均匀，老龄培养物中，则着色不均，似串珠状；本菌无荚膜、鞭毛和芽孢。

猪坏死性皮炎又叫开疮、眼子病、花疮或旋疮,是由坏死杆菌引起的以皮肤、皮下组织坏死为主要特征的一种慢性传染病。

临床上以体表皮肤及皮下发生坏死和溃疡,多发于耳部、颈部、臀部、膝关节及四肢外侧等处,个别猪发生于尾部,最后腐烂脱落。

病猪临床表现为精神沉郁、食欲不振、营养不良、体质瘦弱、有的出现跋行、甚至卧地不起。

发病初期患病部位皮肤为圆形或椭圆形肿块、硬固、无痛、有热感、患部脱毛、皮肤变白,有的部位盖有干痂,最后创口处流出灰黄或灰棕色有恶臭味的脓汁；创口边缘不整齐,创面凹凸不平,呈紫红色,平均体温为40.1℃。

对死亡猪进行剖检,肝质地变硬、并且表面有少量大小不等的坏死灶；肾被膜剥离困难,其中有的猪可能出现肺脏发生气肿,有灰黄色坏死结节；胃壁和肠黏膜有纤维样坏死性炎症；膀脱黏膜增厚；脾脏肿大、淤血、尤以边缘最为严重；患部皮下坏死灶溃烂到深层组织,发病率达14.49%(10/69),致死率达20%(2/10)。

由于该病常导致猪只死亡,饲料报酬低下,从而给养猪业造成严重经济损失。

本病无特异性菌苗预防方法，只有采取综合性防制措施，加强饲养管理，搞好环境卫生和消除发病诱因，避免皮肤和粘膜损伤。

平时要保持圈舍环境及其用具的清洁与干燥，使地床平整，粪尿污水常清，防止动物互相啃咬，不到低洼潮湿不平的泥泞地放牧，牛、羊、马要正确护蹄，在多发季节，可在饲料中加抗生素类药物进行预防。

1发病情况1.1发病情况该猪场现有400头母猪，繁殖三元杂交猪，现有15日龄左右的哺乳仔猪12窝165头，密度较大。

仔猪均按常规保健，于13日龄开始发病：

急性死亡，患病仔猪精神不振，食欲减少，喜卧挤堆。

3天内发病率70%，死亡率49%。

日龄稍长者，病猪头颈部、腹部等出现大小不等的红斑，暗褐色，破裂渗出浆液，与皮屑、皮脂腺和污垢混合，逐渐蔓延至全身表皮，干燥后形成微棕色磷片状结痂。

母猪未见异常。

1.2剖检病变肾脏色淡肿大、有多量细小出血点，包膜剥离困难，纵向切开见切面内有较多渗出液。

全身淋巴结肿大，中度出血。

部分肺叶间质增宽。

心包软化。

其他器官未见异常。

2实验室诊断2.1细菌分离(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中24h，使表面无水滴凝结。

也可凝成平板后直接使用。

(2)将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡2060min，让细菌释放到灭菌水中。

(3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。

划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。

灭菌后再划第三次线。

(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28℃恒温箱中培养。

13d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。

(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。

同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。

要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。

同时，无菌挑取病死猪心脏、肝脏涂片，革兰氏染色后镜检。

2.2生化试验将菌株接种于乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇培养基中，并进行靛基质试验和尿素酶试验。

靛基质试验试验方法：

将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于361C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2～3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。

尿素酶试验试验方法：

挑取18～24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于361℃培养10，60和120min，分别观察结果。

或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。

培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。

2.3药敏试验药物敏感纸片购自杭州天和生物制品公司，批号：

20080806。

(1)从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，制作涂片观察(2)在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。

(3)用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。

(4)将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。

每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。

每个纸片中心间距24mm。

纸片一旦与平板接触，不应再移动。

(5)贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。

(6)孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS手册比较，作出结果判断。

结果判定按照抑菌圈直径大于25mm为高度敏感，介于16mm-25mm之间为中度敏感，小于16mm为不敏感。

2.4PCR检测PCV-22.4.1引物设计参考文献所述PCV-F:5-TGACCTGTCTACTGCTGTGA-3`,下游引物:PCV-R:5’-CCGTGGATAGTTCTGTAGCA-3-,扩增的片段为473bp。

由上海生工生物公司合成。

2.4.2PCR检测取病猪的淋巴结、脾脏、肝脏和肾脏组织。

采取SDS-EDTA裂解并经苯酚/氯仿抽提，最后以无水乙醇沉淀病毒DNA。

对DNA进行粗略紫外分析定量。

PCR方法参照文献所述方法进行。

最后取PCR产物7.5l于1%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统观察结果。

以本实验室以前分离到的PCV-2病料作为阳性对照，PCV-2阴性血清作为阴性对照。

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2.退火（25℃-65℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：

在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过95℃变性、60℃退火和72℃延伸，DNA含量即增加一倍。

2.5抗体检测分别采集部分发病仔猪及母猪的血液，各6头份，分离血清，使用ELISA法检测PCV-2、PRRSV、HCV、PRV抗体，胶体金试纸条检测HCV抗原。

.(1)稀释液将待检样品1：

40稀释后加入板孔中，每孔加100ul。

再用样品稀释液1：

40稀释阴、阳血清对照，阴、阳对照各设一孔，每孔100ul。

另设一空白对照孔，空白对照孔加100ul稀释液。

轻轻振匀（勿溢出）孔中样品，置37℃温育30分钟。

(2)甩掉板孔中的溶液，用洗涤液200ul/孔洗板5次，每次在干净吸水纸上拍干。

(3)每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP混合物）100ul，置37℃温育30分钟。

重复洗涤。

(4)每孔加底物A液、B液各1滴，室温避光显色10分钟。

每孔加终止液1滴(50ul),10分钟内测定结果。

2.6实验地点聊城大学农学院预防兽医研究室。

3结果与分析3．1培养特性无菌取仔猪心脏、肝脏涂片，革兰氏染色后镜检，见到多形性的革兰氏阴性菌。

将病死猪心脏、肝脏接种于普通营养琼脂培养基，37℃培养24h。

形成表面光滑、边缘整齐、不透明、突起、白色的圆形菌落。

在胰蛋白胨大豆肉汤培养基上正常生长，挑起菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检，见到呈球杆装或短杆状的小杆菌和呈长丝状的较大杆菌。

3．2生化鉴定将菌株接种于乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇培养基中，产酸不产气。

靛基质试验阴性，M.R.试验阳性。

VP试验弱阳性，硝酸盐还原为亚硝酸盐，凝固酶试验阳性。

3．3药敏试验结果抑菌环直径(mm)分别为达氟沙星24，恩诺沙星23，环丙沙星21，新霉素18，多粘菌素B10，庆大霉素7，卡那霉素6，链霉素8，青霉素3，土霉素0。

3．4抗体检测结果所有12份血清样品中，猪瘟、PRRS以及PRV抗体均合格（OD630均在0.4和0.8之间），但是总体水平不高。

猪瘟抗原检测均为阴性。

PCV-2抗体检测显示58.3%（7/12）阴性，16.7%阳性（2/12），其余可疑。

3.5PCR检测结果肝脏、肾脏和淋巴结病料中扩增出大小约473bp的目的片段，结果见图1。

4讨论PCV-2引起PDNS发病猪的日龄一般普遍在80日龄（30公斤体重）以上。

但现在日龄多有偏小，一般发生在15～30公斤体重猪。

本次病例显示，只有15日龄的哺乳仔猪亦可发病，PDNS的发病日龄可能正在降低。

PDNS一般引起肾脏出血，兵力剖检发现肾脏切开后有多量渗出液，是否由于和坏死杆菌混合感染引起的尚未得知。

坏死梭杆菌广泛存在于自然界，如动物饲养场、污水、土壤等，亦存在于健康动物的口腔、肠道和外生殖器等处，临床上主要经损伤的皮肤、粘膜而侵入畜体组织。

猪坏死杆菌多呈地方性流行，疫情爆发的诱因可能是由于气候炎热，连绵阴雨，圈舍潮浊污秽，导致蚊蝇大量滋生，蚊蝇叮咬损伤皮肤、粘膜，致使猪自身抗病力下降，坏死杆菌乘虚而入，导致疫情发生。

猪的坏死杆菌病，死亡率不是很高，但是发生该病后，因其体表受到感染，甚至皮下也会损伤，从而严重影响肉品的质量而造成经济损失。

猪的坏死杆菌病能够反复发生，因此我们必须高度警惕。

只要平时多注意管理，经常保持猪舍的清洁、干燥，可以有效预防本123456图1.病料的PCR扩增结果Fig.1PCRamplificationofsamples1.阳性对照2.肝脏样品3.肾脏样品4.淋巴结样品5.DL200marker6.阴性血清对照1.positivecontrol2.liversamples3.kidneysample4.lymphnodessample5.DL200marker6.negativeserumcontrol病的发生。

这两种疫病混合感染引起了高发病率和死亡率。

环境条件差，猪群密度大，也加剧了该病的严重性。

5结论(1)本次发生的疫病经临床症状、细菌学检验、PCR检验以及血清学等实验室检验方法确诊为由环病毒2型引起的PDNS与疑似坏死杆菌混合感染。

进一步确诊由别的同学进行实验证实。

采取了消毒、添加敏感性抗生素和抗病毒治疗措施，现在疫情已经得到了控制。

(2)猪群发生本病后，必须早诊断、早治疗，及时采取综合性的防治措施，才能使疫情很快得到控制，则会造成大批死亡。

需要加强消毒，加强饲养管理，饲料配合原料多样化，增强猪体的抗病力。

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