超高效液相色谱-质谱法测定食物中毒样品中α-茄碱和α-卡茄碱

1/1超高效液相色谱-质谱法测定食物中毒样品中α-茄碱和α-卡茄碱超高效液相色谱-质谱法测定食物中毒样品中-茄碱和-卡茄碱超高效液相色谱-质谱法测定食物中毒样品中-茄碱和-卡茄碱刘红河康莉廖仕成刘桂华深圳市疾病预防控制中心摘要：

目的建立一种超高效液相色谱-串联质谱联用法测定包括土豆、加工食品、血清及尿液中龙葵素主要成分-茄碱和-卡茄碱的确证方法,为龙葵素中毒提供证据和治疗依据。

方法粉碎均匀样品用5%乙酸水溶液进行超声提取,对于土豆样品,提取液用乙腈稀释后上机测定;加工食品、患者呕吐物样品、血液和尿液样品的提取液采用MCX固相萃取柱进行净化,用含5%氨水的乙腈洗脱,收集流出液,将流出液在50℃水浴下氮吹浓缩至干。

加入1.0mL乙腈-水(90+10,v/v)溶解,过0.22m滤膜。

待测物经WatersUPLCBEHAmide柱分离,选用含2mmol/L乙酸铵的乙腈-水为流动相,10min内梯度洗脱分离-茄碱和-卡茄碱;在优化的质谱条件下,采用ESI源、正离子模式、多反应监测方式,外标法定量。

结果在浓度范围1.0~200.0g/L内-茄碱和-卡茄碱在不同基质样品中均有良好的线性关系,相关系数r在0.9988~0.9997,土豆样品的最低检测限为0.60g/kg(-茄碱)和0.21g/kg(-卡茄碱),血液或尿液样品分别为0.08g/L(-茄碱)和0.04g/L(-卡茄碱)。

方法回收率在82.6%~105.5%之间,RSD为1.93%~5.11%。

结论该方法测定各种中毒样品中-茄碱和-卡茄碱的残留量简便、快速、准确,可以用于因龙葵素中毒的应急事件处理,为临床治疗提供依据。

关键词：

茄碱;色谱法,高压液相;食物中毒;：

作者简介：

刘红河(1970),男,硕士研究生,主任技师,主要从事食品理化检验研究工作收稿日期：

2016-02-03基金：

深圳市科技计划(医药卫生类)资助项目(编号:201302146)Determinationof-solanineand-chaconineinfoodpoisoningDeterminationof-solanineand-chaconineinfoodpoisoningsamplesbyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometrysamplesbyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometryLIUHong-heKANGLiLIAOShi-chengLIUGui-huaShenzhenCenterforDiseaseControlandPrevention;Abstract：

ObjectiveAnultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(UPLC-MS/MS)methodwasestablishedfordeterminationof-solanineand-chaconineeinfoodpoisoningsamplesincludingpotatoes,processedfood,vomit,serum,andurine.MethodsThesampleswereextractedwith5%aceticacidbyultrasonicinstrument.Forpotatosample,thesupernatantwasdilutedwithacetonitrileanddetectedbyUPLC-MS/MS.Forsamplesofprocessedfood,vomit,serum,andurine,thesupernatantswerecleaned-upbysolid-phaseextractionwithamixedmodecationexchange,andelutedwithacetonitrile(containing5%ammoniawater).Thenthepurifiedsolutionwasconcentratedbynitrogen,dissolvedwithacetonitrile-water(90+10,v/v)andcleanedby0.22mmilliporefilter.ThesampleextractwasseparatedonaWatersUPLCBEHAmidecolumnbygradientelutionin10minuteswithacetronitrilewater(containing2mmol/Lammoniumacetate)asmobilephase.ThefiltratewasdetectedbyUPLC-MS/MS,identifiedbyelectrosprayionizationinpositivemodeusingmultiplereactionmonitoring,andquantifiedwithexternalstandards.ResultsThecalibrationcurvesof-solanineand-chaconineeinseveralpoisoningsamplesshowedgoodlinearityintherangeof1.0-200.0g/Lwithcorrelationcoefficientintherangeof0.9988-0.9997.Thedetectionlimitofthemethodwere0.60g/kg(-solanine)and0.21g/kg(-chaconinee)forpotato,0.08g/L(-solanine)and0.04g/L(-chaconinee)forserumandurine.Therecoveriesofthreespikinglevelsrangedfrom82.6%to105.5%,andRSDsof1.93%-5.11%wereobtained.ConclusionThismethodissimple,rapid,andaccurateforthedeterminationofresiduesof-solanineand-chaconineeinpoisoningsamplesandcanbeusedforemergencydetectionofsolaninepoisoning.Keyword：

Solanine;Chromatography,highpressureliquid;Foodpoisoning;Received：

2016-02-03土豆是受人们欢迎的粮食作物之一,在许多国家和地区作为主食食用。

但土豆植株及其块茎中含有有毒糖苷生物碱龙葵素(Solanine),特别是变绿或发芽的土豆中龙葵素含量会显著增高[1-2]。

龙葵素主要成分为以茄啶为糖苷配基构成的茄碱和卡茄碱,一共有6种不同的糖苷生物碱,其中-茄碱(-solanine)和-卡茄碱(-chaconinee)含量占土豆所有6种糖苷生物碱的95%,是土豆龙葵素的主要形式[3-4]。

结构式见图1。

微量的龙葵素具有治疗风湿病、平喘、抗癌等多方面的医疗作用[5]。

但是如果进食龙葵素含量较高的土豆可能引起中毒,成年人1次进食超过200mg龙葵素的量可引起明显的急性中毒反应。

每年世界各地均有龙葵素中毒的事件发生,一般为集体中毒事件,多为食用了发芽、变绿的土豆后引发的中毒[6-7]。

中毒症状包括消化系统、神经系统和胃肠道系统症状,主要表现为恶心呕吐、腹痛、腹泻、头痛、眩晕、发热、瞳孔散大、呼吸困难、颜面青紫,严重者可昏迷抽搐,甚至可因呼吸中枢麻痹而死亡[5]。

目前有关龙葵素的检测尚无国家标准方法,报道也较少,日常的应急检测采用的是利用龙葵素的生物碱特性用不同显色剂产生显色反应的方式来判断,方法的特异性和灵敏度均较差,也无法准确定量。

目前文献报道的方法主要有紫外分光光度法(UV)[8]、薄层色谱法(TLC)[9]、高效液相色谱法(HPLC)[10-11]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等[12-14],检测的对象主要为土豆,对于土豆加工后的食品和疑似中毒患者呕吐物、血清和尿液等生物材料样品的检测报道较少。

本文在总结文献的基础上,以龙葵素的主要成分-茄碱和-卡茄碱作为研究对象,建立了土豆、土豆加工食品、呕吐物、血清及尿液中龙葵素的超高效液相色谱-串联质谱联用测定方法。

方法操作简便、快速、灵敏度高、结果稳定可靠,通过对实际样品进行分析,取得较好的效果,可用于有关土豆中龙葵素引起食物中毒应急检测的高灵敏确证检测。

图1-茄碱(左)和-卡茄碱(右)结构式下载原图1材料和方法1.1仪器APIQTRAP4500三重四极杆串联质谱仪(美国ABSciex公司),ShimadzuLC-20ADXRUFLC超快速液相色谱仪(日本Shimadzu公司);PeekInfinity1031氮气发生器(英国peek公司);XS-205DU十万分之一天平(瑞士Mettler-Toledo公司);KQ-250DV超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);AllegraX-22R高速冷冻离心机(美国BeckmanCoulter公司);TurboVapⅡ型氮吹浓缩仪(美国Caliper公司);MS3型漩涡振荡器(德国IKA公司);OasisMCX固相萃取柱,60mg,3mL(美国Waters公司);0.22m有机系针筒式微孔滤膜过滤器。

1.2试剂-茄碱(alpha-Solanine),纯度99.6%;-卡茄碱(alpha-Chaconine)纯度99.9%,均购于美国ChramaDex公司。

乙腈、甲醇、正己烷和甲酸均为色谱纯(德国Merck公司),水为二次蒸馏超纯水,实验所用其他试剂除已注明外均为分析纯。

1.3样品来源包括加工食品(清炒土豆和土豆烧肉),模拟中毒患者呕吐物、血清和尿液样品(非龙葵素中毒患者生物材料样品添加适量龙葵素标准充分混匀所得样品),超市采购5批土豆样品。

1.4实验方法1.4.1样品提取1.4实验方法1.4.1样品提取土豆样品的提取:取1g(精确到0.01g)粉碎均匀的土豆样品于50mL离心管中,加入4mL5%乙酸水溶液,涡流混合2min后,超声提取15min,于5000r/min离心15min,取上清液0.50mL用乙腈定容到5mL,过0.22m滤膜,上机测定。

另取同一粉碎均匀的土豆1g(精确到0.01g)6份,分别用4mL70%甲醇溶液超声提取15min、4mL乙醇-乙酸水浴回流提取60min和4mL乙醇-乙腈-冰乙酸(5+3+2)混合溶剂超声提取15min等3种提取方法进行提取,每种方法平行处理2份样品,按上面方法进行处理后上机测定,以比较不同提取条件下提取效率。

加工食品或患者呕吐物样品的提取:取1g(精确到0.01g)混匀的加工食品或患者呕吐物样品于50mL离心管中,加入4mL5%乙酸水溶液,涡流混合2min后,超声提取15min,加入5mL乙腈,再超声10min,于5000r/min离心15min,避开表面油脂层取上清液1.0mL,用5%乙酸水溶液定容到5mL,待SPE净化。

血液和尿液样品的提取:取血液或尿液样品0.10mL,于15mL离心管中,加入0.90mL5%乙酸水溶液充分混匀,涡流混合2min,超声10min,再加入2mL乙腈,再超声10min,于5000r/min离心10min,取上清液,用5%乙酸水溶液定容到5mL,待SPE净化。

1.4.2固相萃取净化分别采用C18、混合阳离子交换树脂(MCX)、混合阴离子交换树脂(MAX)、弱阳离子交换树脂(WCX)等填料的固相萃取柱进行净化,固相萃取柱依次用2mL乙腈和2.0mL5%乙腈水溶液活化后,将上面加工食品、患者呕吐物、血液或尿液样品提取液分别加入不同SPE柱,弃去流出液;一批样品依次用2.0mL水和2.0mL5%乙腈水溶液淋洗柱子,另取一部分样品依次用2.0mL5%乙酸水和2.0mL10%乙腈水溶液淋洗柱子;弃去流出液,抽干SPE柱;C18填料的SPE柱用5.0mL乙腈洗脱,MCX和WCX填料的SPE柱用5.0mL含5%氨水的乙腈洗脱,MAX填料的SPE柱用5.0mL含5%乙酸的乙腈洗脱;收集流出液,将流出液在50℃水浴下氮吹浓缩至干。

加入1.0mL乙腈-水(90+10,v/v)溶解,过0.22m滤膜,上机分析。

1.4.3液相色谱分析条件选择分别用WatersUPLCBEHC18(2.1mm50mm1.7m)、WatersUPLCBEHC18(2.1mm100mm1.7m)、WatersUPLCBEHHILIC(2.1mm100mm1.7m)和WatersUPLCBEHAmide(2.1mm100mm1.7m)4种色谱柱进行分离检测,流动相为A为含2mmol/L乙酸铵的水溶液,B为含2mmol/L乙酸铵的乙腈溶液;柱温30℃。

进样体积:10L。

统一采用梯度洗脱程序,见表1。

表1-茄碱和-卡茄碱流动相梯度洗脱条件下载原表1.4.4质谱定性及定量优化条件选择离子源为ESI(+),检测方式:多反应离子监测(MRM),利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果。

在300~700℃之间采用50℃步长优化离子源温度,最终确定550℃;在3000~5500V之间采用100V为步长优化喷雾电压,最终确定为4500V;同样采用自动扫描优化的方式确定入口电压为10V、气帘气压力为206.8kPa,碰撞气流速为中等、源内气流速为55L/min、辅助气流速为55L/min、驻留时间为100ms;采用蠕动泵进样方式手动优化的其他MRM,参数见表2。

表2-茄碱和-卡茄碱MRM部分参数表下载原表1.4.5标准溶液配制及样品检测分别称取0.00500g-茄碱和-卡茄碱标准品,用甲醇定容至5mL,配制成浓度为1.0g/L标准储备液,于-20℃冰箱内避光保存。

分别吸取-茄碱和-卡茄碱标准储备液各1mL,用乙腈稀释至100mL,得到-茄碱和-卡茄碱质量浓度为10g/mL的混合标准中间液。

准确移取1.0mL10g/mL标准中间液于10mL棕色容量瓶中,用乙腈定容至10mL,制备成浓度为1.0g/mL的标准使用液。

标准曲线绘制:对于土豆、加工食品和患者呕吐物样品,分别吸取1.0g/mL标准使用液0.0、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0L,用起始流动相配成质量浓度为0、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0g/L的系列标准溶液,进样测定后绘制标准曲线;血清和尿液样品选取经预实验证实不含-茄碱和-卡茄碱的空白血清或尿液作为基质匹配样品,取7份空白血清或尿液样品各0.1mL,分别加入1.0g/mL标准使用液0.0、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0L,按样品前处理方法进行处理后,制备成基质加标工作曲线,浓度依次为0、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0g/L,测定后绘制标准工作曲线。

将上述处理好的样品液进样10L,和标准系列一起用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行分离检测,相应的标准曲线外标法进行定量计算。

1.4.6准确度和精确度测定由于难以找到不含-茄碱和-卡茄碱的空白基质土豆样品,本研究中挑选采用预实验测定含量较低的土豆样品来进行准确度和精密度实验。

土豆粉碎混匀后取1.00g于50mL离心管分别加入-茄碱和-卡茄碱含量均为0.1、1.0、10.0mg/kg3个浓度水平的标准使用液,血液和尿液样品取0.10mL分别加入-茄碱和-卡茄碱浓度为0.01、0.1、1.0mg/L3个浓度水平的标准使用液,每个水平均制备6份加标样品,同时准备2份样品用于测定本底值。

将上述样品按照样品处理方法进行处理,上机测定。

2份平行样品测定结果均值作为样品本底值,计算加标回收率,以回收率作为准确度指标,以同一加标水平6份样品测定结果的相对标准偏差(RSD)作为精密度指标。

2结果和讨论2.1样品提取条件的优化目前文献报道的土豆样品龙葵素的提取方法效果较好的主要有4类[15-16]:70%甲醇溶液超声提取、乙醇-乙酸水浴回流提取、乙醇-乙腈-冰乙酸(5+3+2)混合溶剂提取法和乙酸溶液漩涡振荡提取,本研究中采用在同一份粉碎均匀的土豆参照文献方法分别用不同提取方法提取后测定-茄碱和-卡茄碱的含量,根据绝对含量高低来判断提取效率,结果见表2。

采用甲醇超声提取和乙醇-乙酸水浴回流等方式处理样品,提取效率偏低;乙酸溶液漩涡振荡提取方式,提取操作简单,在乙酸浓度为5%~15%时提取效率最高(同一样品测定含量最高),同样对于血清、尿液及呕吐物等样品也得出一样的结果,因此最终所有样品均采用含5%乙酸的水溶液提取。

表3不同提取方式测定结果(mg/kg)下载原表2.2固相萃取条件的优化本研究发现样品经5%乙酸水溶液提取后,采用加入乙腈使蛋白变性沉淀可达到较好的净化效果。

土豆样品提取后回收率可达到80%以上,说明土豆基质对测定干扰不严重,不需要进一步的净化,而加工食品、呕吐物、血清和尿液样品由于基质比较复杂,存在较严重基质干扰,仅采用乙酸水溶液提取和加入乙腈使蛋白变性后测定回收率仅在50%左右,达不到定量分析要求,需要采用进一步净化手段,本研究考虑采用固相萃取这种目前通用的有机物净化手段来进行净化。

比较C18、MCX、MAX、WCX等不同填料的SPE柱,发现采用C18小柱净化的回收率小于30%,MAX小柱回收率仅约为20%,WCX小柱回收率也仅约为50%。

由于-茄碱和-卡茄碱为碱性化合物,适合用MCX固相萃取小柱进行净化。

样品采用乙酸溶液提取后,可以使待测物-茄碱和-卡茄碱带上正电荷而被MCX小柱保留,用含5%氨水的乙腈溶液可将待测物洗脱。

采用在不同样品中添加最终含量为10mg/kg的标准品进行测定来考察提取物的基质干扰情况及固相萃取小柱的净化效果。

经过MCX净化后,加标回收率显著提高(回收率可由50%提升达85%以上)。

经过这些净化步骤,土豆、加工食品、呕吐物等样品基质效应不太明显,但血清和尿液样品仍有少量的基质增强效应。

由于缺少同位素内标,同时也难以找到不含龙葵素的土豆、加工食品、呕吐物等样品,本方法仅对血清和尿液样品采用基质加标来制备工作曲线进行定量,以抵消基质增强效应,土豆、加工食品、呕吐物等样品测定采用标准曲线法进行定量,方法操作简单、结果可靠。

2.3色谱条件的选择-茄碱和-卡茄碱为碱性化合物亲水性的化合物,因此重点比较了几种适合极性物质保留的色谱柱,C18柱无法分离2种成份(见图2A、B);HILIC柱分离效果较好,保留时间适中,但对-茄碱测定较差,灵敏度也稍低(见图2C),而Amide柱,2种物质均峰形尖锐、灵敏度较高,因此实际测定选用WatersUPLCBEHAmide色谱柱,结果见图2D;液质联用所用流动相常用为乙腈-水和甲醇-水,在流动相中添加甲酸、乙酸铵、乙酸等以提高离子化效率,通过比较几种不同的流动相体系和添加甲酸和乙酸铵,发现流动相添加2mmol/L乙酸铵-茄碱和-卡茄碱的灵敏度、分离度和峰形均达到最好。

图2土豆样品中-茄碱和-卡茄碱的在不同色谱条件下的总离子流(TIC)及定量离子色谱图下载原图图2土豆样品中-茄碱和-卡茄碱的在不同色谱条件下的总离子流(TIC)及定量离子色谱图下载原图注:A:C18柱分离效果图;B:HILIC柱分离效果图;C:Amide柱分离效果图;D:WatersUPLCBEHAmide色谱柱效果图2.4质谱的定性及质谱优化条件选择根据-茄碱和-卡茄碱的分子结构特征,本研究中选择了ESI(+)电离模式。

用针泵连续直接进样,分别对喷雾电压、离子源温度、气帘气、碰撞气、源内气、辅助气、去簇电压、入口电压、碰撞气能量、碰撞池电压等质谱参数进行了优化,以确定-茄碱和-卡茄碱的母离子和子离子,以强度较大的子离子作为定量离子,而以强度稍小的子离子作为定性离子,以样品中定量离子和辅助定性离子这两对离子强度比不得超过系列标准溶液相应的离子强度比均值的20%作为定性确证的质量控制依据。

各化合物定量离子及定性离子详见表1。

2.5线性范围和检出限在上述分析条件下,以-茄碱和-卡茄碱的标准峰面积为纵坐标,以-茄碱和-卡茄碱的浓度为横坐标,计算标准曲线的线性回归方程,见表3。

结合取样量以3倍信噪比在标准曲线查得结果分别计算土豆、加工食品、呕吐物、血清和尿液样品的检出限(LOD),结果见表3。

表3-茄碱和-卡茄碱的标准曲线、线性范围及检出限下载原表2.6准确度和精密度此方法对3类样品3种浓度水平加标平均回收率为82.6%~105.5%,RSD为1.93%~5.11%(见表4),该方法精密度好,稳定可靠。

表4-茄碱和-卡茄碱的加标回收率和精密度试验结果(n=6)下载原表2.7实际样品检测用建立的方法分析了某食物中毒患者呕吐物、血液、尿液,土豆加工食品及5批市售土豆样品,结果见表5。

食物中毒患者的呕吐物、血液、尿液均未检出-茄碱和-卡茄碱,事后该患者的临床诊断上也排除了龙葵素中毒。

土豆样品均不同程度检出-茄碱和-卡茄碱,土豆茎块中-茄碱和-卡茄碱含量分别在0.1~15.6mg/kg和0.3~26.2mg/kg范围内,土豆皮中-茄碱和-卡茄碱含量分别在22.7~128.5mg/kg和39.3~404.0mg/kg范围内,提示土豆皮中龙葵素含量显著高于土豆茎块,在食用时应去皮以免发生中毒。

3结论本次建立的是测定土豆、加工食品、呕吐物、血清和尿液样品中-茄碱、-卡茄碱的超高效液相色谱-串联质谱联用测定方法。

样品采用5%乙酸水溶液提取其中的-茄碱和-卡茄碱,提取液加入乙腈沉淀蛋白后,用5%乙酸水稀释降低乙腈含量比例后,采用MCX固相萃取小柱净化,在优化的液相色谱条件与质谱仪器条件下对样品进行检测,取得较好的效果,该分析方法快速,准确,选择性好,可作为公共卫生突发事件土豆中毒的快速确证检测,为公共卫生突发事件的应急检测和临床中毒病人的诊断确认提供了有效的技术手段。

表5实际样品中-茄碱和-卡茄碱的测定结果(mg/kg)下载原表参考文献[1]GrunenfelderLA,KnowlesLO,HillerLK,etal.Glycoalkaloiddevelopmentduringgreeningoffreshmarketpotatoes(SolanumtuberosumL.)[J].JAgricFoodChem,2006,54(16):5847-5852.[2]杨亮,高荣,陈朗,等.储藏条件对马铃薯块茎肉质部分-茄碱含量的影响[J].作物研究,2012,26(5):487.[3]FriedmanM,DAOL.Distributionofglycoalkaloidsinpotatoplantsandcommercialpotatoproducts[J].JAgricFoodChem,1992,40(3):419-423.[4]JadhavSJ,SharmaRP,SalunkheDK.Naturallyoccurringtoxicalkaloidsinfoods[J].CritRevToxicol,1981,9(1):21-104.[5]巩江,倪士峰,丘莉惠,等.龙葵素的药理毒理及药用研究[J].安徽农业科学,2009,37(9):4108-4109.[6]任志远.一起马铃薯龙葵素引起的食物中毒[J].疾病监测,2008,23(5):267.[7]周兴,林党柒,杨