生物工程专业《发酵工程实验》教学大纲

【发酵工程实验】【FermentationEngineeringExperiment】一．基本信息课程代码：【109581】课程学分/学时：【2/80】面向专业：【生物工程】课程性质：【实践教学必修课】开课院系：生物与医学工程学院使用教材：主教材【自编实验讲义】辅助教材【生物工程专业实验，中国轻工业出版社，贾士儒主编，2004】参考教材【发酵工程实验技术，化学工业出版社，陈坚等，2003】前修课程：【微生物学103651（4.0）；生物工艺原理100141（3.0），生物过程与设备100831（3.0）】二．课程目标发酵工程实验是生物工程专业本科课程教学体系的综合性的应用实践课程。发酵工程既是生物工程的重要支撑课程之一，也是生物技术产业化的关键。作为一门实验科学，生物工程领域所取得的每一个进步，都与实验技术的发展密切相关。这就要求从事生物工程领域的研究人员，不仅要掌握本学科坚实的基础理论知识，更应掌握娴熟的实验操作技能，从而从实验中获得正确可靠的数据，发现并解决研究开发中出现的问题，进而指导新理论的建立或加速新产品的开发。发酵工程实验的开设对于学生学习、理解及应用生物工程的理论知识具有举足轻重作用。通过本课程的学习，使学生掌握一定的发酵工程方面的实验基本原理、方法与技能，加深学生对生物工程理论知识的理解，并培养学生将理论与实践相结合，提高学生解决实际问题的能力。要达成的课程目标如下:课程目标1（知识目标）:掌握微生物生长曲线的绘制；掌握发酵罐的正常使用、保养及注意问题；掌握发酵装置供氧能力及发酵时微生物耗氧的测定方法；掌握发酵产物的分离、纯化及鉴定方法。

课程目标2（能力目标）:掌握发酵工程实验基本原理对生物工程复杂工程问题进行分析、研究与解决，得出有效结论。能针对发酵工程实验问题提出单元操作和工艺流程解决方案，在方案中综合运用发酵工程实验知识和设计规范。能根据工程实践学习经历对解决方案的可行性进行初步评价；在发酵工程实验的设计中体现创新意识，分析改进的方案。针对发酵工程实验相关领域的复杂工程问题，能够组建多学科背景的项目团队，管理并带领团队完成任务。在发酵工程实验过程中，能够掌握工程管理原理和经济决策方法，初步开展实验设计。

课程目标3（素质目标）:学生树立远大抱负与脚踏实地相统一的信念，增强解决实际问题的决心和能力。明确利用现代科学技术方法解析中国传统生物技术产业的重要性，引导学生正确认识世界与中国的发展，增强制度自信、文化自信，增强时代责任感和历史使命感。能根据工程实践学习经历对解决方案的可行性进行初步评价；在发酵工程实验的设计中体现创新意识，分析改进的方案。学生了解发酵工艺对“大众创业、万众创新”和“中国制造-2025”国家发展战略的支撑作用，对国家新近发表的生物智造与绿色化工、生物制药主导作用。

三．课程目标和毕业要求的对应关系和支撑矩阵表1课程目标和毕业要求的对应关系和支撑矩阵毕业要求毕业要求指标点课程目标及其支撑强度系数课程目标1课程目标2课程目标3支撑强度3.设计开发能力：掌握生物工艺学、生物分离工程、生物过程与设备、细胞工程、基因工程等的基本原理，针对生物工程及其相关领域的复杂工程问题的具体情况和特点，研发相关新方法及新工艺及相关设备。3.2了解生物工程设计和开发的全周期、全流程；能针对生物工程和工艺问题提出单元操作和工艺流程解决方案，在方案中综合运用生物√H3.3能根据工程实践学习经历对解决方案的可行性进行初步评价；在生物工程、工艺装备与系统的设计中体现创新意识，分析改进的方案。√H9.个人和团队：能够在多学科背景下的团队中承担个体、团队成员以及负责人的角色。9.3针对生物工程相关领域的复杂工程问题，能够组建多学科背景的项目团队，管理并带领团队完成任务。H11.项目管理能力：理解并掌握工程管理原理与经济决策方法，并能在多学科环境中应用。11.2在生物工程实践过程中，能够掌握工程管理原理和经济决策方法，初步开展工程设计。H四．课程内容（一）教学内容结构关系图（二）课程内容发酵工程实验以生物工程专业工科大学毕业生必须掌握基本操作技术为核心，包括：生物工艺过程相关参数检测技术、生物发酵培养技术、生物过程控制技术、生物物质提取和纯化技术等在内的一系列基本操作技术。表2课程内容及对应的课程目标课程内容（具体内容见下）对应课程目标学生学习成果学时安排实验一细菌生长曲线测定1,2通过细菌数量的测定了解大肠杆菌的生物特征和微生物在一定条件下生长、繁殖的规律，绘制生长曲线；掌握光电比浊法测定细菌数量的方法。2天实验二5L发酵罐发酵外源重组角蛋白实验（机械搅拌生物反应器的使用方法）1,2，3学习生物反应器的原理，学习机械搅拌生物反应器的安装和使用。掌握发酵过程参数的控制及测定。学会发酵参数的设置，掌握发酵液参数的测定方法。机械搅拌生物反应器的安装及空罐灭菌、实罐灭菌。接种大肠杆菌发酵，取样分析：取样菌体量的分析：于A620nm处菌液浊度与细胞菌数。1天实验三动态法测定摄氧率、KL•a及呼吸临界氧浓度1,2,3掌握发酵过程中微生物的摄氧率、呼吸临界氧浓度及设备的KL•a的测定。3天实验四外源重组蛋白分离纯化1,2,3利用新和层析柱分离纯化外源重组蛋白，进一步掌握蛋白纯化的柱层析及电泳操作。通过填柱、加校、洗脱等过程得到基因工程重组蛋白。2天实验五外源重组蛋白鉴定（WesternBlot）1,2,3利用蛋白印迹鉴定外源重组蛋白诱导表达条件及生产量。通过灌胶、电泳、转膜、印迹等，学生进一步掌握WesternBlot操作过程。得到外源重组蛋白鉴定结果图片。2天合计10天具体实验内容为：实验一细菌生长曲线测定【目的与要求】1．通过细菌数量的测定了解大肠杆菌的生物特征和微生物在一定条件下生长、繁殖的规律，绘制生长曲线；2．学习光电比浊法测定细菌数量的方法。【原理与内容】大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的细菌细胞每30min分裂一次。将一定量的细菌转入合适的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。因此，测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，对于人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。本实验利用采用比浊法，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光光度计（Spectrophotometer）测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的光密度值（OD值）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。【思政元素】微生物生长的过程符合Logistic模型，它的应用从增长模型拓展到很多领域，广泛应用于生物学、医学、经济管理学等方面。这个模型也可以拓展应用到个人、机构甚至国家发展层面，引导学生树立中华民族崛起的理论必然性。引入1945年7月，黄炎培作为国民参政员参访延安，行将结束他给毛泽东谈参访感想时，提出了“周期率”：其兴也勃焉，其亡也忽焉。以及《左传·庄公十一年》郭沫若农民起义李自成失败的《甲申三百年祭》，这了避免这种“必然”的衰落，毛泽东思想提出了“两个务必”。引导学生在学习上也要处于如微生物生长对数期的状态，这样才能不断进步，不断有收获。实验二5L发酵罐发酵外源重组角蛋白实验（机械搅拌生物反应器的使用方法）【目的与要求】学习生物反应器的原理，学习机械搅拌生物反应器的安装和使用。掌握发酵过程参数的控制及测定。学会发酵参数的设置，掌握发酵液参数的测定方法。【原理与内容】机械搅拌生物反应器的安装及空罐灭菌、实罐灭菌。接种大肠杆菌发酵，取样分析：取样菌体量的分析：于A620nm处菌液浊度与细胞菌数；葡萄糖浓度的测定：3，5二硝基水杨酸测糖法。【思政元素】合成生物学应用的核心为万物合成及万物转化，以发酵为中心的合成生物学可应用在医药、农业、环境、食品、工业、纺织等各个领域。道德经：上善若水,水善万物而不争,天下莫能与之争。作为合成生物学核心之一的发酵工程实验就是要承载这种功能：以其为技术应用于各个领域而不显现。引导学生在做人上也要富有水的精神。实验三动态法测定摄氧率、KL•a及呼吸临界氧浓度【目的与要求】发酵过程利用微生物的生长和代谢来生产各种产品，而在发酵过程中微生物的呼吸情况是一个非常重要的参数，它直接对产量的高低和质量的好坏产生影响，因此掌握发酵过程中微生物的摄氧率、呼吸临界氧浓度及设备的KL•a的大小对控制好生产具有十分重要的意义，所以在生产中常需要加以测定。本实验对生长期的上述参数进行测定。【原理与内容】在发酵过程中，当供氧和需氧达到平衡时，在溶氧仪上应看到溶氧曲线呈一条直线，若在此时停止通气，则由于微生物的呼吸消耗了发酵液中的溶解氧，因此可见溶解氧值迅速下降，在溶氧曲线上可看到，此时溶解氧以一条直线向下降，此直线的斜率即为摄氧率（r）。此直线下降到发酵液的溶解氧的量不足以维持微生物正常呼吸时直线开始弯曲，此最低点即为不影响微生物呼吸的最低溶解氧浓度，一般称微生物的呼吸临界氧浓度（C临）。此时再恢复通气，溶解曲线开始上升，上升的幅度是由微生物的需氧和设备的供氧共同作用的结果。从曲线的变化即可计算出微生物的摄氧率、呼吸临界氧浓度和设备的KL•a。【思政元素】溶氧（DO）是需氧微生物生长所必需的。空气中的氧须先溶解在培养液中，然后再传递到细胞内的呼吸酶位置上，才能被利用。发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。矛盾的焦点是氧在培养基中溶解度太小，为此，需讨论影响需氧和供氧的因素及如何解决这对矛盾。这包括一系列氧的传递过程。氧从空气中溶解入培养液并到达微生物菌体表面，这个过程为供氧过程；氧进入细胞并到达呼吸酶位置，这个过程为耗氧过程。而氧在发酵液中的传递，需要突破8个阻力，大部分氧分子在碰见阻力时都会转入对流状态，而只有极少数的分子会突破阻力转成层流状态，成功被利用。人的成功不也是这样吗，碰到挫折时，只有少部分人会奋斗，最终成功；大部分人遇见挫折会回头或无策，最终泯然众人矣。引导学生在挫折面前（特别是实验失败时）不放弃，向前冲，最终会取得成功。实验四外源重组蛋白分离纯化【目的与要求】利用新和层析柱分离纯化外源重组蛋白，进一步掌握蛋白纯化的柱层析及电泳操作。通过填柱、加校、洗脱等过程得到基因工程重组蛋白。【原理与内容】亲和层析(AffinityChromatography)是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆的结合，可以用于对生物分子的分离纯化。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。直到60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在生物分离中有广泛的应用。同时它也可以用于某些生物大分子结构和功能的研究。His-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同，Ni2+亲和层析柱可分为俩类一Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六个整合价位，其中Ni-IDA合了三价，Ni-NTA合了四价。所以IDA的载量要比NTA的高，在同样条件下Ni-IDA洗脱时的咪浓度也高于Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。

Ni柱中的氯化镍可以与有His-Tag的融合蛋白结合，也可以与咪进行结合，当标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合时，不同浓度的咪通过层析柱，就会将与镍配位的标签蛋白，杂蛋白等分别洗脱下来从而得到高纯度目标蛋白。【思政元素】结合微生物外原表达物质，已可利用微生物生产多种中药有效在份，如青蒿素，引入中国制造素材+植物源提取物（来自中医药）。增加同学们的民族自信心。在该实验中分小组协作实验，可锻炼学生团队合作的科学精神。通过实验垃圾分类及实验室卫生管理）实验室安全、公民品格。家国情怀：有国才有家；有家才有国。课程—专业—择业实验五外源重组蛋白鉴定（WesternBlot）【目的与要求】利用蛋白印迹鉴定外源重组蛋白诱导表达条件及生产量。通过灌胶、电泳、转膜、印迹等，学生进一步掌握WesternBlot操作过程。得到外源重组蛋白鉴定结果图片。【原理与内容】与SouthernBlot或NorthernBlot杂交方法类似，但WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。【思政元素】尽管通过过合成生物学能够在底盘细胞中构建各种物质的表达，进而通过发酵生产。但这个研发与生产过程需要伦理及法治意识：认识到哪些物质是法律法规禁止合成的。五．课程考核方式与评分标准（一）课程考核方式考核方式包括实验考勤、实验操作及实验报告，考核内容及所见比例如下。表3课程成绩构成表课程目标考核内容考核方式课程目标占总成绩的比例实验考勤、实验操作实验报告课程目标1微生物生长曲线的绘制；发酵罐的使用及保养；发酵装置供氧能力及发酵时微生物耗氧的测定；发酵产物的分离、纯化及鉴定。

70%40%50%课程目标2发酵工程实验基本原理对生物工程复杂工程问题进行分析、研究与解决；针对发酵工程实验问题提出单元操作和工艺流程解决方案，在方案中综合运用发酵工程实验知识和设计规范；工程实践学习经历对解决方案的可行性进行初步评价；在发酵工程实验的设计中体现创新意识，分析改进的方案。针对发酵工程实验相关领域的复杂工程问题，能够组建多学科背景的项目团队，管理并带领团队完成任务。在发酵工程实验过程中，能够掌握工程管理原理和经济决策方法，初步开展实验设计。20%35%30%课程目标3树立远大抱负与脚踏实地相统一的信念，增强解决实际问题的决心和能力。利用现代科学技术方法解析中国传统生物技术产业的重要性，正确认识世界与中国的发展，制度自信、文化自信，时代责任感和历史使命感。工程实践学习经历对解决方案的可行性进行初步评价；在发酵工程实验的设计中体现创新意识，分析改进的方案。学生了解发酵工艺对“大众创业、万众创新”和“中国制造-2025”国家发展战略的支撑作用，对国家新近发表的生物智造与绿色化工、生物制药主导作用。10%25%20%考核方式占总成绩的比例50%50%100%（二）评分标准1、实验报告评分标准实验报告满分均为100分，60分及以上为及格。每位学生