β-细辛醚对谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护作用

1/1β-细辛醚对谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护作用-细辛醚对谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护作用作者：

陈奕芝,方永奇,梁毅,王绮雯,何玉萍【摘要】目的研究-细辛醚对谷氨酸所诱导的PC12细胞损伤的保护作用,并探讨其作用机理。

方法用谷氨酸造成PC12细胞损伤模型,观察-细辛醚对其细胞形态、损伤程度、存活力、钙离子浓度和细胞凋亡的影响。

结果10mmol/L谷氨酸作用PC12细胞16h,出现明显损伤,凋亡率和死亡率升高,培养上清液中LDH含量增加；7.5、15、30g/mL-细辛醚可有效改善谷氨酸损伤引起的PC12细胞形态改变,提高细胞存活力,减少乳酸脱氢酶渗漏；15、30g/mL-细辛醚能明显降低谷氨酸引起的PC12细胞内钙离子浓度和细胞凋亡率。

结论-细辛醚对谷氨酸所致PC12细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与钙拮抗作用有关。

【关键词】PC12细胞；谷氨酸；钙；-细辛醚Abstract：

ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsof-asaroneonPC12cellsdamageinducedbyGlutamate.MethodTheeffectsof-asaroneonPC12cellsafterGlutamateintoxicationonmorphology,extentofdamage,livability,intracellularcalciumconcentrationandapoptosisratiowereobserved.ResultMorphologicalchanges,LDHleakageandintracellularcalciumconcentrationincreasing,andcellsurvivaldecreasingwereobservedinPC12cellsexposuredtoGlutamate.7.5,15,30g/mL-asaronecanincreasecellsurvival,decreaseLDHleakage.15,30g/mL-asaronecanreduceintracellularcalciumconcentrationandapoptosisratio.Conclusion-asaronepreventsthetoxicityofGlutamate,anditmaybeattributetoitseffectofanticalcium.Keywords：

PC12cells；Glutamate；Ca2+；-asarone本实验采用体外培养PC12细胞方法,用谷氨酸(Glu)造成损伤模型,观察-细辛醚对PC12细胞形态学、细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞内游离钙和细胞凋亡率的影响。

1实验材料1.1细胞、药物和试剂高分化PC12细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。

Glu为Amresco产品；高糖DMEM粉剂培养基、胎牛血清、马血清、0.25%胰酶均为GIBCO产品；噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品；磷酸缓冲液(PBS)、二甲基亚砜(DMSO)为北京鼎国产品；Annexinv-FITC试剂盒购自晶美生物工程有限公司；Fluo-3/AM为BiotiumInc产品；LDH试剂盒购自南京建成生物工程研究所；细胞培养板为CORNING产品。

-细辛醚的制备由本中心完成,纯度99.44%。

临用前称取适量-细辛醚与吐温-80及甘油,以1∶1∶1充分混匀后加灭菌双蒸水配成终浓度为10mg/mL-细辛醚溶液,用时培养基稀释至所需终浓度。

1.2主要仪器设备CO2培养箱(NUAIK)；倒置相差显微镜(OLYMPUS)；BIO-RAD550型酶标仪；ALTRAEPICS流式细胞仪(BECKMANCOULTER)；6010紫外可见分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司)。

2实验方法2.1造模复苏后的PC12细胞接种于25cm2培养瓶中,培养液为含5%马血清、5%胎牛血清的DMEM高糖培养基,37℃、5%C02培养箱中培养。

待细胞长满单层,0.25%胰酶消化,用含血清的DMEM培养基终止消化并调细胞密度为5104个/mL,接种在96孔培养板(弃去四周边孔),每孔100L,四周边孔每孔加入等体积PBS溶液,待细胞贴壁生长交叉成网后用于实验。

实验分为正常对照组、Glu(0.3～76.8mmol/L)损伤组,继续培养16h后观察细胞形态改变,并用MTT法检测细胞活力。

2.2药物保护实验PC12细胞接种于96孔(每孔100L)及24孔培养板(每孔1mL),培养条件同上,待细胞铺满单层,吸弃原培养基,用PBS液洗1次,随机分为6组。

正常对照组和Glu损伤组加入无血清培养基,阳性对照组加入终浓度为10mol/L尼莫地平,-细辛醚设3个剂量组,分别为7.5、15、30g/mL,培养4h后,除正常对照组外,其余各组荡洗后加入终浓度为10mmol/L的Glu继续培养16h,用于各指标检测。

2.3观察指标细胞形态学观察、存活力(MTT法)、培养上清液LDH活性(比色法)、凋亡率和胞内钙离子浓度(流式细胞仪荧光染色法)。

2.4统计学方法数据以xs表示,采用SPSS11.0软件包分析,组间比较采用单因素方差分析。

3结果3.1谷氨酸对PC12细胞的损伤作用PC12细胞培养2h后完全贴壁,呈神经细胞样形态,圆形,折光性较强,生长速度快,2d后生长成网状。

PC12细胞经不同浓度Glu作用16h后,0.3～4.8mmol/LGlu对PC12细胞形态学和细胞活力没有明显变化,而9.6～76.8mmol/LGlu则对PC12细胞有不同程度的损伤,表现为细胞变圆、皱缩,部分贴壁不良、脱落,裂解成碎片,折光度下降,细胞活力也明显下降,且呈剂量依赖关系,故本实验选用10mmol/LGlu为造模浓度(见表1)。

尼莫地平及-细辛醚预孵育4h,其细胞形态无明显变化。

表1不同浓度Glu对PC12细胞活力的影响(略)注：

与正常对照组比较,*P0.001。

3.2-细辛醚对造模PC12细胞活力、谷氨酸的影响(见表2)表2-细辛醚对造模PC12细胞活力和LDH的影响（略）注：

与正常对照组比较,*P0.01,**P0.001；与Glu组比较,△P0.01,△△P0.001(下同)。

3.3-细辛醚对造模PC12细胞凋亡率、胞浆游离钙的影响(见表3)表3-细辛醚对造模PC12细胞凋亡和细胞内钙离子浓度的影响(略)4讨论PC12细胞株来源于大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞,生长迅速、稳定,不易发生自动转化,可建立能传代的二倍体细胞系[1]。

其细胞形态、结构和功能皆类似于神经细胞,成为近年来研究神经细胞递质合成、储存和释放、离子通道规律及受体的细胞模型[2]。

Glu是一种中枢兴奋性氨基酸递质,过量的Glu可促使突触前过量的蛋白激酶C(PKC)向细胞膜转移并活化,从而过度激活突触后膜的Glu受体NMDA受体,促使Ca2+内流。

细胞内Ca2+浓度上升又可激活细胞内的硫蛋白酶(calpin-I),引起细胞内骨架蛋白-fordrin降解,使膜上Glu结合位点数量明显增加,导致胞内Ca2+超载,出现迟发性损害[3]。

本实验用Glu造成PC12细胞损伤,通过观察和检测细胞形态学、细胞存活力、LDH释放量以及细胞凋亡和细胞内钙离子浓度的变化,探讨-细辛醚对PC12细胞Glu损伤的保护作用及其作用机理。

本研究结果表明,PC12细胞受到Glu损伤后,细胞存活率降低、LDH漏出率升高、细胞凋亡率和死亡率升高、细胞内钙离子浓度升高；-细辛醚能提高细胞存活率、降低LDH漏出率、抑制细胞凋亡和死亡、降低细胞内钙离子浓度。

-细辛醚与PC12细胞预温育4h,可选择性降低Glu引起的细胞内游离Ca2+浓度的异常升高,抑制细胞凋亡,这可能是-细辛醚能特异性且剂量依赖性地抑制Glu与其受体相结合,从而抑制受体门控钙通道的开放,减少胞外游离钙进入细胞内,减轻Glu的兴奋性毒性有关,从分子水平上初步阐明了-细辛醚对兴奋性神经毒的保护作用机制。

兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤作用总是伴随着钙超载现象,笔者认为,-细辛醚对Glu引起的PC12细胞损伤的保护作用可能与其钙拮抗作用有关。

【参考文献】[1]张均田,张庆柱.神经药理学研究技术与方法[M].第2版.北京：

人民卫生出版社,2005.9.[2]ShafterTJ,AtchisonWD.Transmitter,ionchannelandreceptorpropertiesofPC12cells：

amodelforneurotoxicologicalst