艾灸对溃疡性结肠炎大鼠肺组织巨噬细胞功能表型蛋白调节作用的研究-0

1/1艾灸对溃疡性结肠炎大鼠肺组织巨噬细胞功能表型蛋白调节作用的研究艾灸对溃疡性结肠炎大鼠肺组织巨噬细胞功能表型蛋白调节作用的研究艾灸对溃疡性结肠炎大鼠肺组织巨噬细胞功能表型蛋白调节作用的研究张丹1,2,杨延婷2,林晋安2,贾一凡2,黄燕2,李志元2,刘婕1,施征1,吴焕淦1,马晓芃11上海市针灸经络研究所，上海200030，中国2上海中医药大学，上海201203，中国【摘要】目的：

观察艾灸对溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)大鼠肺组织巨噬细胞分化重要功能表型CD86、CD163表达的影响，并基于巨噬细胞分化关键细胞因子干扰素(interferon-gamma,IFN-)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-)、白介素4(interleukin-4,IL-4)和白介素13(interleukin-13,IL-13)研究艾灸调节肺组织巨噬细胞分化的作用机制。

方法：

将40只清洁级SD大鼠随机分为正常组、模型组、普通艾灸组和无烟艾灸组，采用抗原免疫结合局部福尔马林灌肠法制备UC大鼠模型，普通艾灸组大鼠双侧天枢穴接受艾灸治疗，无烟艾灸组大鼠双侧天枢穴接受无烟艾灸治疗，每次灸10min，每日1次，共8d。

实验结束，采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察结肠组织病理学变化，运用免疫印迹法(westernblotting,WB)观察肺组织中巨噬细胞分化重要功能表型CD86、CD163的表达，采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)观察肺组织微环境中巨噬细胞分化关键细胞因子IFN-、TNF-、IL-4、IL-13的含量。

结果：

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织损伤严重，结肠大体评分及组织学评分明显升高(P0.05)。

与模型组比较，接受艾灸治疗的两组大鼠组织病变均有所改善，表现为溃疡修复，炎症减轻，两组大鼠结肠大体评分及组织学评分均降低(P0.05)。

与正常组比较，模型组大鼠肺组织CD86表达增加(P0.05)，CD163表达降低(P0.05)。

与模型组、无烟艾灸组比较，普通艾灸组大鼠肺组织CD86表达显著降低，CD163表达升高(均P0.05)，而无烟艾灸组与模型组相比，差异无统计学意义(P0.05)。

与正常组比较，模型组大鼠肺组织微环境中巨噬细胞分化关键细胞因子表达异常，表现为IFN-和TNF-含量增加(均P0.05)，IL-4和IL-13含量减少(均P0.05);与模型组及无烟艾灸组比较，普通艾灸组大鼠肺组织中IL-4、IL-13含量明显升高，IFN-、TNF-含量减少(均P0.05)，无烟艾灸组与模型组相比，差异无统计学意义(P0.05)。

结论：

艾灸能上调UC大鼠肺组织中巨噬细胞重要功能表型CD163及分化关键细胞因子IL-4、IL-13表达，下调活化表型CD86及分化关键细胞因子IFN-、TNF-的表达。

【关键词】灸法;结肠炎,溃疡性;穴,天枢;巨噬细胞;干扰素-;肿瘤坏死因子;白细胞介素溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis,UC）以结肠非特异性炎症为重要病理变化，以腹痛、腹泻、脓血便为主要临床症状。

病情的反复发作和长期医疗经历严重影响着UC患者及家庭的生活质量[1-2]。

艾灸具有温经散寒，温通经络，活血逐痹，补虚助阳，消瘀散结以及防病保健的功效，是公认临床治疗UC的优选替代疗法，因其操作简单安全、疗效肯定并无明显副作用特点，引起了广泛关注。

临床证实，以天枢、气海为主穴的隔药灸疗法对UC患者具有良好临床疗效[3-8]。

目前关于艾灸作用机制尚无明确定论，传统观点认为热效应与艾烟是重要的影响因素[9-12]。

研究显示，UC模型大鼠肺组织形态结构、微生态、炎性因子分泌及免疫反应等出现异常，表明肺与大肠在生理病理存在着一定联系[13-16]。

因此，本研究建立UC大鼠模型，观察UC大鼠肺组织巨噬细胞（Macrophage,M）分化重要功能表型CD86、CD163及微环境巨噬细胞分化关键细胞因子干扰素(interferon-gamma,IFN-)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-)、白介素4(interleukin-4,IL-4)和白介素13(interleukin-13,IL-13)的变化，并探讨艾灸对其的调节作用，以期为阐明艾灸治疗UC的作用机制提供科学研究资料。

1材料与方法1.1实验动物清洁级SD雄性大鼠40只，体重（15010）g，由上海中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产饲养许可证号：

SCXK（沪）2012-0002，适应性饲养3d。

1.2模型制备采用抗原免疫加福尔马林局部刺激复合法制备大鼠实验性UC模型[17]。

造模结束后，每组随机选取大鼠1只，脱颈处死，自肛门上2cm开始剪取6~8cm结肠组织，用10%中性福尔马林固定，分别采用巨检(grossexamination)与镜检，观察模型大鼠结肠组织病理学变化，确认模型成功与否。

1.3主要试剂与仪器完全弗氏佐剂（Sigma,美国）；艾绒艾条、无烟艾条（南阳汉医艾绒有限责任公司，中国）；HE染色试剂盒（南京建成生物有限公司，中国）；IFN-、TNF-、IL-4、IL-13ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，中国）；CD86、CD163抗体（SantaCruz，美国）；正置荧光显微镜（Olympus，日本）；酶标仪（Bio-Tek，美国）；垂直电泳仪，湿转膜仪及全自动凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）。

1.4分组与处理实验大鼠随机分为正常组(normalgroup,NG)、模型组(modelgroup,MG)、普通艾灸组(normalmoxibustiongroup,NMG)和无烟艾灸组(smokelessmoxibustiongroup,SMG)，每组10只。

除正常组外，其余三组大鼠均按上述方法制备UC模型。

确认模型制备成功后进行分给干预。

正常组：

不做任何治疗，只做与治疗组相同的抓取固定。

模型组：

不做任何治疗，只做与治疗组相同的抓取固定。

普通艾灸组：

取双侧天枢穴[18]，采用温和灸。

将动物实验专用细艾条点燃后在天枢穴处施灸，距离穴位表面约2～3cm，以大鼠不挣扎为度，每隔5s弹灰1次。

每次每穴温和灸10min，每日1次，共灸8d。

无烟艾灸组：

穴们、灸法操作及灸治疗时间均与艾灸组相同，但用动物实验专用无烟艾条施灸，每日1次，共灸8d。

1.5指标检测1.5.1结肠病理学观察采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察结肠组织病理变化。

结肠组织进行脱水、包埋、切片及烤片处理。

二甲苯、梯度酒精中脱蜡至水，苏木精染液染色5min，1％盐酸酒精分化，1%氨水返蓝，0.5％伊红染液染色3min，再依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，烘片镜检。

1.5.2肺组织匀浆上清液中细胞因子含量检测采用酶联免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)双抗体夹心法测定肺组织中巨噬细胞分化关键细胞因子干扰素(Interferon-gamma,IFN-)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-)、白介素4(interleukin-4,IL-4)和白介素13(interleukin-13,IL-13)含量。

加入待测样本及标准品40L/孔，再加入亲和素10L，充分混匀，37℃温育30min,弃上清液,用洗涤液洗涤5次，再加入酶标试剂50L/孔，37℃温育30min，弃上清液，用洗涤液洗涤5次，依次加入显色剂A50L/孔、显色剂B50L/孔，充分混合，37℃避光显色15min，加入终止液50L/孔，终止反应，450nm波长下测定光密度(opticaldensity,OD)值，含量与OD值之间呈正线性关系，通过绘制标准曲线求出标本中各细胞因子浓度。

1.5.3肺组织匀浆上清液中CD86、CD163蛋白检测蛋白检测采用免疫印迹法(westernblotting,WB)技术观察肺组织中巨噬细胞分化表型CD86、CD163蛋白表达情况。

用RIPA裂解液提取肺组织蛋白，BCA法测定组织总蛋白浓度。

制备10%分离胶与5%积层胶，上样总量为40g/30L，110V电泳2～3h，100V湿转2h，5%BSA室温封闭1h，一抗（CD861:500;CD1631:500）4℃杂交过夜，0.1%T-TBS漂洗3次，15min/次，HRP+二抗（1:10000）室温杂交1h，0.1%T-TBS漂洗3次，15min/次，滴加ECL显影液，曝光，全自动凝胶成像系统分析软件扫描灰度值并记录。

1.6统计方法实验结果采用SPSS18.0软件进行统计分析。

若数据符合正态分布且方差齐，则用均数标准差表示，采用One-wayANOVA分析，组间两两比较则采用最小显著差异（leastsignificantdifference,LSD）检验;若数据非正态分布或方差不齐，则用中位数（四分位数间距）表示，采用非参数检验。

统计结果以P0.05表示差异具有统计学意义。

2实验结果2.1一般情况正常组大鼠饮食活动正常，精神状态良好，毛发有光泽，大便成形，质地中等，肛周红润，未见异常分泌物，笼具干燥。

与正常组比较，模型组大鼠饮食减少，精神差，易激惹，毛发干枯，便质稀或不成形，肛周红肿伴异常分泌物，体重增加缓慢(P0.05)。

与模型组比较，艾灸治疗的两组大鼠饮食、大便及精神状态改善，体重相对增加明显(P0.05),艾灸治疗的两组间无统计学差异(P0.05)，图1。

Figure1.各组大鼠体重增加情况[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05]2.2结肠组织病理学巨检：

正常组大鼠结肠黏膜表面光滑，皱襞纹路清晰，质软，色白，伴见少量血管。

与正常组比较，模型组大鼠结肠有不同程度肿胀，肠壁充血，质地偏厚，色暗或偏红，甚者可见局部白色溃疡面、点，大体损伤评分升高(P0.05)。

与模型组比较，艾灸治疗的两组大鼠的结肠肿胀、增厚、充血、溃疡等大体损伤改善，与模型组相比，大体损伤评分明显降低，差异具有统计学意义(P0.05)；艾灸治疗的两组比较，大体损伤评分无统计学差异(P0.05),图2。

Figure2.各组大鼠大体损伤评分[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05]镜检：

正常组大鼠结肠结构良好，黏膜连续覆盖，单层柱状上皮，肠腺有序排列整齐，部分腺腔直接向肠腔开口，黏膜下层结缔组织疏松，伴见血管、淋巴、神经，肌层结构完整，未见溃疡、坏死、炎症浸润。

模型组大鼠结肠严重损伤，多处溃疡面，黏膜层腺体坏死，黏膜层与黏膜下层有大量炎性细胞浸润，组织结构层次不清，与正常组相比，病理组织学评分升高(P0.05)。

与模型组比较，艾灸治疗的两组大鼠结肠病理损伤均有不同程度改善，表现为黏膜层能基本连续分布，腺体增生明显，黏膜层与黏膜下层轻度水肿伴少量炎性细胞浸润，偶见溃疡。

与模型组、无烟艾灸组比较，普通艾灸组病理学损伤评分显著降低，差异具有统计学意义(P0.05)。

无烟艾灸组与模型组比较，差异无统计学意义(P0.05)，图3、图4。

图3.各组大鼠病理学损伤评分[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05;comparedwiththesmokelessmoxibustiongroup,3)P0.05]2.3肺组织匀浆上清液中CD86、、CD163蛋白表达蛋白表达与正常组比较，模型组大鼠肺组织匀浆上清液中CD86蛋白含量显著增加，CD163蛋白含量显著减少(P0.05)。

与模型组、无烟艾灸组比较，普通艾灸组大鼠肺组织匀浆上清液中CD86蛋白含量降低，CD163蛋白含量升高(P0.05)，提示普通艾灸能影响UC大鼠肺组织M分化，调节肺组织中M功能表型蛋白CD86/CD163表达。

无烟艾灸组与模型组相比，差异无统计学意义(P0.05)，图5和图6。

2.4肺组织匀浆上清液中细胞因子TNF-、IFN-、IL-4、IL-13含量与正常组比较，模型组大鼠肺组织中TNF-和IFN-含量明显增加，IL-4和IL-13含量减少，差异具有统计学意义(P0.05)。

与模型组、无烟艾灸组比较，普通艾灸组大鼠肺组织中TNF-和IFN-含量显著降低，IL-4和IL-13含量增加，差异具有统计学意义(P0.05)，提示普通艾灸能降低UC大鼠肺组织TNF-和IFN-含量，增加IL-4和IL-13含量。

无烟艾灸组与模型组比较，差异无统计学意义(P0.05)，图7-图10。

图5.各组大鼠肺组织匀浆中CD86蛋白表达[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05;comparedwiththesmokelessmoxibustiongroup,3)P0.05]图6.各组大鼠肺组织匀浆中CD163蛋白表达[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05;comparedwiththesmokelessmoxibustiongroup,3)P0.05]图7.各组大鼠肺组织匀浆中TNF-含量[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05;comparedwiththesmokelessmoxibustiongroup,3)P0.05]图8.各组大鼠肺组织匀浆中IFN-含量[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05;comparedwiththesmokelessmoxibustiongroup,3)P0.05]图9.各组大鼠肺组织匀浆中IL-4含量[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05;comparedwiththesmokelessmoxibustiongroup,3)P0.05]图10.各组大鼠肺组织匀浆中IL-13含量[Note:Comparedwiththenormalgroup,1)P0.05;comparedwiththemodelgroup,2)P0.05;comparedwiththesmokelessmoxibustiongroup,3)P0.05]3讨论UC的发病原因与机制目前尚不明确，异常免疫反应是其重要的影响因素。

UC属于中医久痢、腹痛、腹泻等范畴。

作为炎症性肠病（inflammatoryboweldiseases,IBD）的一种，UC以典型肠道症状(腹痛、腹泻及脓血便)为主要表现，病情缓解与发作反复交替，病程迁延不愈，结肠纤维化及结肠癌是UC后期致死的重要原因。

研究发现，21%~36%的IBD患者存在着肠外表现，可累及所有器官系统；约0.21%的UC患者可出现肺部症状，病情经糖皮质激素治疗缓解，提示这些表现可能与UC有共同的免疫致病机制[19-21]。

中医传统理论认为肺与大肠相表里，肺与肠在生理病理上相互影响。

近几年，研究发现一定比例的UC患者伴随肺组织损伤及相应临床症状[22-25]。

肺损伤或是UC重要的肠外表现之一。

流行病学调查显示，58.6%的UC患者出现气短、咳嗽症状，63.3%的UC患者存在肺功能异常，这些肺部病变常与UC活动性及病变程度相关，以活动期和轻中度UC患者肺功能改变尤为突出[26-30]。

景珊等研究表明UC模型大鼠存在肺组织炎症损伤、肺功能异常及肺组织分泌型免疫球蛋白A（secretoryimmunoglobulin,sIgA）表达异常[31]，但UC患者肺组织中M的变化尚未见有报道。

M因不同的激活环境而呈现不同的分化状态和功能高度异质性。

M1型M激活主要由IFN-和TNF-介导，表达重要功能表型CD86，促进抗原提呈，增强吞噬，与免疫损伤有关。

M2型M则由IL-4和IL-13激活，表达功能表型CD163，与消解炎症，促进肿瘤形成有关[32-34]。

本实验结果显示，UC模型组大鼠肺组织存在着异常免疫状态，主要表现为调节CD86+M激活的关键细胞因子IFN-和TNF-分泌异常升高，M重要活化表型蛋白CD86表达明显增加，肺组织M多呈现M1型特质。

艾灸具有操作简单、作用温和的特点，能有效缓解结肠组织病变和改善患者生活质量，已逐渐成为临床治疗UC的首选替代疗法。

本研究发现，艾灸具有缓解UC模型大鼠结肠损伤并促进粘膜修复的作用，表现为普通艾灸组、无烟艾灸组大鼠结肠局部炎性细胞浸润相对减轻和溃疡的愈合；与模型组比较，艾灸治疗的两组大鼠大体评分降低（P0.05）；与模型组和无烟艾灸组比较，普通艾灸组大鼠结肠组织学评分显著降低（P0.05）；无烟艾灸组大鼠结肠组织学评分与模型组差异无统计学意义（P0.05）。

艾灸的作用成分复杂、作用途径多样。

光辐射热效应是艾灸起效的重要机制[35-37]。

随着艾烟有效成分的揭示及艾烟安全性问题的被关注，艾烟生物学功能及其对机体器官的影响也逐渐引起大家的关注和认可。

实验表明艾烟能增强肺泡M活性并对肺组织环境具有一定调节作用，促进损伤修复[38-41]。

本研究显示，与模型组、无烟艾灸组比较，普通艾灸组大鼠肺组织中CD86表达明显降低，CD163升高，肺组织微环境中IL-4和IL-13含量明显增加，IFN-和TNF-表达减少，提示艾灸组大鼠肺组织中M多表现M2型特征，肺微环境中细胞因子分泌趋向于激活M2型M。

普通艾灸组和无烟艾灸组大鼠结肠损伤均有一定改善，但对肺M重要功能表型蛋白及细胞因子表达的影响不同，进一步分析发现产生温热刺激是两者的共同点，这个共同点也许是促进结肠损伤修复的重要因素；此外两组的干预方法也存在一定差异，前者燃烧产生艾烟，后者燃烧无烟雾产生，这种不同点抑或是造成两组大鼠肺组织M特征差异的可能因素。

关于是否是艾烟产生了这种特异性肺部变化并参与了结肠损伤愈合的正面调节作用则有待于进一步研究证实。

本研究表明，艾灸能促进UC大鼠肺组织中M重要功能表型蛋白CD163及M分化关键细胞因子IL-4和IL-13表达，抑制功能活化表型蛋白CD86及相应细胞因子IFN-和TNF-表达，促进M从M1型向M2型转化。

艾灸对UC大鼠结肠组织损伤修复的促进作用是否与其艾烟调控肺组织微环境中M分化关键细胞因子分泌从而抑制M异常活化有关，尚待于进一步的实验研究证实。

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