胰岛素的制备

关于胰岛素的制备必要性胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。第2页,共43页，星期六，2024年，5月第3页,共43页，星期六，2024年，5月原理基因工程技术主要内容或步骤可分为目的基因制备和分离，构建DNA重组体；DNA重组体扩增和表达，重组体筛选和鉴定；外源基因表达，产物分离纯化和鉴定以及将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下次进行功能性表达，生产出人类所需要的物质。第4页,共43页，星期六，2024年，5月预想把人的胰岛素的基因提取出来，接在一个小的载体上，得到一个重组的载体，再转化到真核细胞，细胞并不认为是人的基因就不管它，会当成自己的基因进行胰岛素的合成，每一个细胞就相当于生产胰岛素的工厂，实际上我们可以通过改变胰岛素基因前面的调控序列，让细胞停止合成其他的蛋白质，只合成胰岛素。第5页,共43页，星期六，2024年，5月但是胰岛素的A链、B链分别表达后如何使其正确连接成了人们关注的问题。

第6页,共43页，星期六，2024年，5月人胰岛β细胞生成胰岛素过程主要分为三个阶段：第一步，机体首先合成由109个氨基酸组成的前胰岛素原。第二步，前胰岛素原脱去23个氨基酸，转变成含有86个氨基酸的胰岛素原。胰岛素原分子量为9000，是长的单链，含胰岛素的A链和B链及连接链。第三步，胰岛素原再脱去4个碱基氨基酸，生成含31个氨基酸的C肽及含51个氨基酸的胰岛素分子。第7页,共43页，星期六，2024年，5月第8页,共43页，星期六，2024年，5月用E.coli做表达系统

及A链、B链分别表达的问题 E.coli是原核生物没有真核生物翻译后加工、修饰。E.coli中表达的小分子外源蛋白不稳定。E.coli与人的种属差异较大，有密码子的偏好性。A链、B链间二硫键正确连接和其空间构象正确形成较难。第9页,共43页，星期六，2024年，5月一些解决办法替换表达系统,换为酵母或动物细胞等真核表达系统。仍用E.coli作为表达系统，将胰岛素基因与一些较大的蛋白分子的基因适当连接，使表达的蛋白分子量足够大，避免被蛋白水解酶分解，提高其稳定性及表达率。在A链、B链间加入C链或其功能类似物，使胰岛素能够形成正确的空间构象。第10页,共43页，星期六，2024年，5月一、人胰岛素原在Pichiapastoris

（毕赤酵母）中的表达毕赤酵母是一种甲醇营养酵母，用酵母合成胰岛素的主要优点是可以进行体内加工形成二硫键的正确配对，产物分泌到培养基中，下游纯化比较简单。甲醇诱导醇氧化酶(AlcoholOxidase)，AOX的表达是在转录水平上调控的，其启动子(PAoxl)属诱导型启动子，能非常有效的控制外源基因的表达。不仅能克服强启动子在宿主细胞内大剂量表达外源蛋白，会导致宿主细胞受损，甚至死亡的缺点，而且能高水平表达。第11页,共43页，星期六，2024年，5月

材料与方法

1．

材料1．1菌种和质粒

E.coli

、JMl09、SMDll68，质粒pUCl8、pHIL—S11．2限制性内切酶

EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ及T4DNA连续酶均购于Promega公司第12页,共43页，星期六，2024年，5月

1．3培养基·LB、YPD、RDB、BMG、BMM其中包括的主要成分YNB(yeastnitrogenbase)购于Difco公司

1．4其它材料DNA回收试剂盒购于原平公司第13页,共43页，星期六，2024年，5月2方法2．1克隆步骤扩增已克隆在质粒pUCl8上的胰岛素原基因，用EcoRI和BamHI双酶切，电泳，琼脂糖凝胶上回收283bp的胰岛素原基因片段，将穿梭质粒同样用EcoRI和BamHI双酶切，65℃，15min，酶灭活。酚抽提，酒精沉淀。溶于0．1XTE中。用T4DNA连接酶连接穿梭质粒与胶上回收片段。氯化钙法转化到大肠杆菌JMl09中，挑单菌落扩增鉴定。第14页,共43页，星期六，2024年，5月第15页,共43页，星期六，2024年，5月第16页,共43页，星期六，2024年，5月2．2表达质粒转化酵母SMDl168菌制备酵母感受态细胞，再将带有外源基因的穿梭质粒线性化，(可用BglⅡ酶切)。可用电激法，也可用invitrogen公司提供的转化试剂盒进行转化。然后在RDB选择培养基上筛选。——般酵母转化菌需在28—30℃长2—4天。第17页,共43页，星期六，2024年，5月2．3．1酵母生长期将转化菌在BMG培养基中生长至OD600=4—6时，4℃离心3000g，5min，弃上清。2．3．2诱导表达期弃上清，菌体重新培养于l／5原体积的BMM培养基中进行诱导。每隔24小时，加0.5％体积的诱导剂—甲醇，诱导时间在100h以上。2．3．3SDS凝胶电泳分析

4℃离心7000g，5min，留上清，电泳分析。2．3．4超滤浓缩与分子筛分离纯化胰岛素原。第18页,共43页，星期六，2024年，5月第19页,共43页，星期六，2024年，5月二.人胰岛素原及其类似物

在E.coli表达系统中的表达为了使表达的胰岛素原稳定采取了下列方法：１．构建双Ｃ肽的人胰岛素基因２．构建融合蛋白基因（其他蛋白基因＋胰岛素原基因）３．构建胰岛素原基因串第20页,共43页，星期六，2024年，5月（一）Met－Lys－双Ｃ肽人胰岛素原基因

的构建表达及分离纯化在研究胰岛素的结构与生物功能的关系中，过去人们一直认为C肽含有使胰岛素二硫键正确配对足够的结构信息。我国科学家在成功地解决胰岛素的A、B链重组问题及随后对交联胰岛素的研究后，人们对“C肽含有使胰岛素二硫键正确配对的足够的结构信息”这一论点产生了质疑。第21页,共43页，星期六，2024年，5月

20世纪80年代至90年代，科学家对不同长度的C肽进行了研究，结果表明，C肽在胰岛素A、B链正确配对时，可能只起柔性连结肽作用，使得双分子反应变为分子内反应。而A、B链包含了足够的使二硫键正确配对的信息，C肽的长短可能对A、B链的重组产生影响。第22页,共43页，星期六，2024年，5月材料与方法1．1材料1．1．1质粒与菌株质粒pJGl03:含B-C-A人胰岛素原基因(Met-HPⅠ）；质粒pJG111：含B—C´—C—A人胰岛素原基因(Met—双C肽—HPⅠ)表达载体；质粒pBV220：温度诱导质粒。第23页,共43页，星期六，2024年，5月1．1．2酶和主要试剂胰蛋白酶(10900U／mg)、人胰岛素(26．0U／mg)、猪胰岛素(26．0U／mg)、羧肽酶B、限制性内切酶、T4DNA连接酶、dNTPs、T4DNA聚合酶、DNA测序试剂盒、T7SequencingTMKit、阴离子交换层析柱ResourceTMQ、SephadexG—75、胰岛素放免试剂盒、人胎盘胰岛素受体。第24页,共43页，星期六，2024年，5月1．1．3引物

5´突变引物

5´GGAATTCCGGATGAAGTTTGTC3´，起始密码子ATG与Phe之间插入了Lys的密码子AAG．测序引物

5´ACGCTTTTGAAGTGAT3´，与双C肽人胰岛素原基因294～279碱基互补．3´通用引物

5´GTCGACGGATCCTCA3´．第25页,共43页，星期六，2024年，5月1．2方法1．2．1重组质粒pJG112(含Met—Lys—双C肽人胰岛素原基因)的构建．第26页,共43页，星期六，2024年，5月第27页,共43页，星期六，2024年，5月以pJG111(含Met—双C肽人胰岛素原基因)质粒DNA作为模板，利用5´端突变引物和3´端通用引物，进行PCR扩增，反应体系总体积50μl，95℃预变性10min后加入1.5UTaq聚合酶，反应参数为93℃,45s；50℃，60s；72℃，90s；35个循环后72℃延伸10min．第28页,共43页，星期六，2024年，5月1．5％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，然后用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，回收后与pJGl03(含B—C—A人胰岛素原基因)载体大片段连接(经EcoR

Ⅰ和BamHⅠ双酶切后回收)，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α．第29页,共43页，星期六，2024年，5月1．2．2质粒pJGll2的筛选和鉴定酶切筛选：将转化出的单菌落采用常规小量质粒制备方法制备质粒DNA，取1μgDNA，用EcoRI和BamHI双酶切后进行1．5％琼脂糖凝胶电泳，凡有约380bp片段出现的重组克隆作序列分析鉴定．第30页,共43页，星期六，2024年，5月温度诱导表达筛选：挑取转化的单菌落，37℃培养过夜，次日扩大10倍37℃培养3h，42℃诱导4—6h。离心得菌体，适量无菌水悬浮后，取适量菌体悬浮液进行15％SDS—PAGE，以pBV220和pJGl03转化菌液作为对照．DNA序列测定：采用izard®plusMiniprepsDNApurificationSystem提取测序模板，采用Sanger双脱氧终止法，测序反应按Pharmacia公司T7SequencingTMKit说明书进行．6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析．第31页,共43页，星期六，2024年，5月1．2．3Met—Lys—双C肽人胰岛素原基因的摇瓶表达挑取单菌落于3mlLBAmp+培养液中，37℃培养12h，扩大100倍30℃培养过夜，次日上午以1：10稀释，30℃培养4h，42℃诱导6h，6000r／min离心收获菌体．第32页,共43页，星期六，2024年，5月1．2．4Met—Lys—双C肽人胰岛素原的分离纯化

20g湿菌体经超声破碎细胞，裂解包含体，还原，重组，超滤浓缩至6～7ml的重组液．经SephadexG—75(1．7cm×l00cm)层析分离，收集目的蛋白．取少量进行“％SDS—PAGE分析，其余的调pH2．5～3．0，加入NaCl使终浓度达12％(W／V)，离心，收集沉淀，冰冻保存．第33页,共43页，星期六，2024年，5月1．2．5Met—Lys—双C肽人胰岛素原转化为人胰岛素取适量上述胰岛素原类似物盐析沉淀溶于0.05mol／LTris—HCLpH7．5缓冲液，经紫外吸收法准确测定Met—Lys—双C肽HPI的浓度后，加入适量胰蛋白酶和羧肽酶B，使质量比例分别为50：1和300：1，37℃反应0．5h，立即冷却，终止反应，酶解液用HCl调pH2．5～3．0，并加入异丙醇使其浓度达40％(V／V)经ResourceTMQ(1m1)阴离子交换柱分离，采用NaCl盐浓度梯度为0～0．15mol/l的上述缓冲液进行洗脱，以猪胰岛素作为对照，收集胰岛素峰，用0．5mol/l乙酸透析除盐，冻干备用．第34页,共43页，星期六，2024年，5月结果

2．l重组质粒的构建利用5´端起始密码子ATG和胰岛素B1TTT之间加入Lys密码子AAG的突变引物相3´端通用引物，以含双C肽胰岛素原基因的质粒pJG111作模板，进行PCR扩增，获得约380bp的产物，由于胰岛素原基因的5´端和3´端分别引入了EcoRI和BamHI酶切位点，因此PCR产物和载体质粒pJGl03(含B—C—A人胰岛素原基因)可分别用这两种酶酶切后产生粘性末端，经回收的PCR产物酶切小片段与载体大片段连接，转化E．coliDH5α后获得重组质粒pJG112，采用3种方法进行筛选和鉴定。第35页,共43页，星期六，2024年，5月首先提取pJG112质粒DNA，经EcoRI和BamHI双酶切筛选，产物进行1．5％琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明双酶切的小片段大小与pJG111双酶切小片段相近，约370bp，比pJGl03双酶切的小片段(约280bp)大，初步说明已获得突变胰岛素原类似物基因，并重组到pJGl03质粒内。第36页,共43页，星期六，2024年，5月第37页,共43页，星期六，2024年，5月鉴于所用载体为一个表达型载体，所以可进行表达筛选．将初步筛选出的阳性克隆小量进行表达，产物进行SDS—PAGE分析，结果表明在电泳条带的前沿有明显表达带，分子大小比