HIV感染的实验诊断培训课件

一、HIV感染后的免疫和病毒学8/23/20241HIV感染的实验诊断HIV的基因组结构和蛋白基质衣壳核衣壳表面糖蛋白跨膜糖蛋白蛋白酶反转录酶整合酶HIV结构基因,有3个env(核苷酸5781--8360)编码包膜蛋白p160、120、41等。gag(核苷酸310--1860)编码病毒核心/衣壳蛋白p55、24、15、17；pol(核苷酸1629--4673)编码逆转录酶(RT)、p66、51、32、11等；HIV调节基因,有6个tat:上调mRNA,促病毒复制-启动rev:调节病毒mRNA-开关vif:增强出芽,释放新病毒颗粒-感染因子nef:下调mRNA,抑病毒复制-制动vpu:仅见于HIV-1,功能不详；vpx:仅见于HIV-2,功能不详。8/23/20242HIV感染的实验诊断8/23/20243HIV感染的实验诊断5days8/23/20244HIV感染的实验诊断脑部：巨嗜细胞和胶质细胞淋巴系统:胸腺淋巴结脾脏肠道：嗜铬细胞前列腺精液阴道黏液骨髓肺胞巨嗜细胞血液细胞积存:CD4+T淋巴细胞巨嗜细胞胶质细胞嗜铬细胞

Imagefrom:KahnandWalker,M.D.NEJM1998,Volume339:33-39

July28/23/20245HIV感染的实验诊断感染HIV后的血清学变化HIVRNA浓度p24AgP24AgAnti-gp41,120,160Anti-p24,55感染1周2周6周12周8－10年急性期潜伏期艾滋病期检出线8/23/20246HIV感染的实验诊断HIV-1早期感染病毒标志物的动态观察HIVRNAHIVp24antigenHIVantibodies窗口期血浆RNAP24前病毒DNAHIV抗体:ELISAHIV抗体:WB8/23/20247HIV感染的实验诊断HIV感染者的三种临床转归VirusCD4CD8aHIVCD4CD4CD8CD8aHIVVirusVirus典型8－10y快速:4-5y:(2%)缓慢/长期不进展:>10y:(2%)8/23/20248HIV感染的实验诊断二、HIV酶联筛查检测方法和试剂※感染急性期，

窗口期※检测试剂以ELISA为主，还有PA，斑点免疫胶体金和免疫层析。※ELISA试剂为HIV1/2型，包括M和O组，N组不包括但很少。※

三四五代酶联试剂的差异和使用策略：三代成熟质量稳定，窗口期20d;四代提前4－9d，质量不稳定，用于血站急性感染的检测。※

筛查试验和确认试验的差异：酶联试验敏感性高于确认试验，四代试剂敏感性更高，确认阴性的不一定是真阴性。

8/23/20249HIV感染的实验诊断（一）HIV抗体ELISA检测试剂（血液）第三代：双抗原夹心法，可检测所有类型抗体，由于能检出IgM抗体，缩短了窗口期，有报道说较第二代产品平均可提前5天作出诊断。第四代：双抗原（抗体）夹心法，将HIVP24抗体和HIV抗原同时包被，再加入待检血清，最后加入酶标记的HIV抗原和HIVP24单克隆抗体，同时检测血清中的HIVP24抗原和HIV抗体。第五代：HIV抗体和P24抗原实现分别检测，真正实现早期诊断。8/23/202410HIV感染的实验诊断FourthGenerationThirdGenerationSecondGenerationIgMIgG8/23/202411HIV感染的实验诊断各种HIV检测方法平均窗口期方法 平均天数第2代EIA 45第3代EIA 22P24抗原 16HIVRNA 118/23/202412HIV感染的实验诊断（二）、检测试剂的质量指标灵敏度诊断试验的灵敏度有两个不同意义：1．代表一个试验能检测最少量被分析物（如抗体）的能力。通常可对阳性血清进行稀释以确认哪个试验更敏感。2．指某试验检出阳性的能力（无假阴性）。一个试验有可能检出很少量的某抗体，但也可因试验中缺少适当的抗原而漏掉一些阳性样品。8/23/202413HIV感染的实验诊断2．特异性指某试验正确鉴定所有阴性的能力（无假阳性）。大部分HIV筛查试验不是100%特异，可用公式计算真阴性特异度=————————

100%

真阴性+假阳性注：公式中真阴性指试验中所能检测的真阴性数。如100份血清，5份真阳性，95份真阴性，与参考试验比较，某试验检出6份阳性（一份假阳性），则

特异性=94/(94+1)×100%=98.9%8/23/202414HIV感染的实验诊断3．试验效率指某试验正确鉴定所有阳性和阴性的总体能力（无假阳性或假阴性），是灵敏度和特异性的综合指标，反映了该试验的总的效率。真阳性+真阴性试验效率=—————————————

100%

真阳性+假阳性+真阴性+假阴性注:公式中真阳性和真阴性指试验数目。在以上例子中，检测100份血清，5份真阳性，95份真阴性，1份假阳性，1份假阴性，因此

4+94

试验效率=————————

100%=98%4+1+94+18/23/202415HIV感染的实验诊断4．预测值预测值与以上的参数不同，它描述的是考虑了被检人群中感染的流行因素后的试验评价。阳性预测值（PPV）：定义为在所有阳性结果人群中感染个体所占比例。阴性预测值（NPV）：定义为在所有阴性结果人群中未感染个体所占比例。真阳性阳性预测值=————————

100%

真阳性+假阳性真阴性阴性预测值=————————

100%

真阴性+假阴性注：公式中真阳性和真阴性指试验数目。8/23/202416HIV感染的实验诊断⑴在感染流行率较高（5%）的人群中1000人受检：50份真阳性（已感染），950份真阴性（未感染），5份假阳性（试验结果），5份假阴性（试验结果），计算

PPV=45/(45+5)×100%=90%NPV=945/(945+5)×100%=99.5%

在另一人群有相同的结果（即相同数量的假阳性和假阴性）⑵在感染流行率较低的人群（0.7%）中

1000人受检：7份真阳性（已感染），993份真阴性（未感染），5份假阳性（试验结果），5份假阴性（试验结果），计算

PPV=2/2+5=28.6%NPV=988/988+5=99.5%

8/23/202417HIV感染的实验诊断5．艾滋病病原诊断中的几个问题⑴明确不同实验方法的意义和适应范围：HIV血清学检测方法可分初筛和确证两类。HIV初筛试验特异性不够强，有时会造成一些假阳性结果，故在初筛试验出现阳性结果时，应再重复试验，若仍为阳性再用确证试验（WestBlot）去证实。但一些非感染者的血液也会对某些抗原显示反应（出现的条带不够判为阳性的标准），在正常的非感染者人群中发生比例<15%，所以如果用WB来测ELISA阴性者的血清，有些标本被视为不确定。出现不确定结果时，可能是HIV早期感染或是非特异反应，应在1-6个月后复查，并结合个体的临床表现、感染因素、WB带型等综合分析后做出结论。8/23/202418HIV感染的实验诊断⑵针对HIV感染不同时期选用不同的检测手段：HIV感染后两周内，无法查到抗体。两周后出现病毒血症，可用P24抗原检测方法或测逆转录酶活性。6-8周后抗体产生时，进行抗体检测。诊断HIV感染在早期可检测抗原，而在感染后的大多数时间，可用血清学方法诊断。8/23/202419HIV感染的实验诊断

⑶HIV抗体测定的预测值：试剂的敏感性和特异性可衡量优劣，但不能完全决定一个测定结果正确与否的可能性大小，与预测值关系更大。預測值除与试剂好坏有关外，还取决于测定对象本身患病率的高低。由表1可以看出：在用ELISA法对高危人群检测时，其阳性预测值为99.98%，而在非高危人群中，阳性预测值仅为18.94%（即查出阳性结果是真阳性的机率只有18.94%），反之阴性结果的机率为99.997%。

8/23/202420HIV感染的实验诊断表1ELISA法HIV1抗体测定的预示值

人群

预示值(%)

阳性阴性旧金山同性恋人群

99.9880.06美国非高危人群

18.9499.9978/23/202421HIV感染的实验诊断⑷HIV抗体检测反应强度与HIV感染的概率：ELISA法可根据光密度（OD）值的强度直接确定。反应越强的血清，含有HIV抗体的可能性就越大。表2中正常献血员（感染率30/10万），中等强度反应时，HIV抗体阳性概率仅为1%，高强度反应时，则为86.1%。见表2。不仅要看阴阳结果，还要看反应强度或S/CO比值。8/23/202422HIV感染的实验诊断表2HIV感染机率与ELISA反应强度的关系

人群HIV感染率（/10万）

ELISA反应强度（%）低度中度高度非高危献血员

300.00071.1386.1高危献血员

950.00223.4895.2军人

1500.00365.3996.9吸毒者

450001.9196.699.98/23/202423HIV感染的实验诊断注：1、数字表示相应强度反应的血清中含有HIV抗体的概率2、低度为S/CO<1,中度为1<S/CO<6,高度为S/CO>6。8/23/202424HIV感染的实验诊断三、确认试验WB为主，还有：线性免疫试验（LIA）,放射免疫沉淀试验（RIPA）和免疫荧光试验（IFA）。WB存有培养病毒的宿主细胞成分，容易出现非特异性反应造成不确定结果，LIA使用重组蛋白（多肽），非特异性大大减少，试剂盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。8/23/202425HIV感染的实验诊断（一）、HIV抗体强度与抗体带型的关系抗体带型<11～55～1010～15>15全带型8条带型6条带型5条带型4条带型3条带型2条带型1条带型11151642106721224612合计1218120498/23/202426HIV感染的实验诊断（二）、HIV病毒载量与抗体带型的关系载量带型5×10～5×102

5×102～103

103～104

104～105

>105全带型8条带型6条带型5条带型4条带型3条带型2条带型1条带型4118171412166331211183322合计697978188/23/202427HIV感染的实验诊断（三）、造成WB假阳性或不确定的原因1.实验室操作中，阴性样本被污染或洗涤不彻底。2.HIV感染急性期，窗口期附近，仅显示gp160或120，或P24，P31，P55带；此时ELISA往往已显示阳性反应

3.晚期AIDS病人，部分抗体如P24，P31丢失4.其他病毒感染的交叉反应，如风疹，麻疹，腮腺炎等5.自身免疫病，高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮）6.肾衰竭和血透析7.遗传性胰腺囊肿8.多次怀孕或输血9.肝病10.乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。11.线粒体核酸和T细胞白细胞抗原引起的抗体8/23/202428HIV感染的实验诊断在无高危行为的献血和孕妇人群中，WB不确定率10-15%，甚至高达32％.Gag蛋白抗体条带最常见。ELISA筛查阳性结果中，WB不确定占4-20%,俄罗斯报告占12.7%。我国，125份确认为HIV-1抗体阳性;条带出现百分率为：gp160、p24为100%,

gp120、gp41、p66、p51和p31在96%以上,p17、p55分别为86.4%和85.6%.

上海，36例WB试验gp120和p24双阳性者的跟踪随访和核酸辅助诊断发现，至少24例可判定为HIV-1感染。5例样本的核酸测定结果与血清学随访检测结果的符合率达到100%。25例随访到的对象中，18例样本平均17天后条带有明显进展，可以判定为HIV抗体阳转。（四）WB不确定结果的有关数据8/23/202429HIV感染的实验诊断（五）假阴性结果指EIA+WB的假阴性原因急性感染后的抗体迟反应不同HIV毒株型发病晚期抗体消失窗口期：几周到6个月，与当地HIV流行率有关HIV亚型，M/N/O组间差异8/23/202430HIV感染的实验诊断（六）、确认试验不确定标本的常规处理按照《全国艾滋病检测技术规范（2004年版）》的要求，只能作“3个月后复检”的处理，三个月后复检1次，连续2次，共6个月。其转归有两种可能：仍呈现不确定或阴性，则诊断为HIV抗体阴性；带型发生进展，符合HIV抗体阳性判断标准，则诊断为HIV抗体阳性。后者是真正的窗口期感染者（一般为2-3个月，最长6个月）

，只占很小的比例；大多数为非感染者，但由于WB反应的敏感性而出现条带。如有必要，可用辅助诊断方法对不确定样本进行实验诊断。8/23/202431HIV感染的实验诊断确认结果不确定标本的辅助诊断1、病毒载量：RT-PCR,NASBA,b-DNA，高拷贝的结果提示感染。小于18个月婴儿在10000拷贝/毫升应做HIV感染处理。