ELISA-技术在禽流感诊断研究中的应用

ELISA技术在禽流感诊断研究中的应用摘要：禽流感（AI）是目前禽类流行的主要疫病之一，给养禽业和人类健康带来了巨大危害。由于禽流感病毒血清型众多，致病疫情多样，因此，适时的检测和早期快速诊断是预防和控制禽流感的前提条件。ELISA方法以其特异、灵敏、快速、简便，可迅速检测大量样品，使用仪器设备少，利于基层操作等优点成为AI流行病学普查及早期快速诊断的最实用和有效的方法。关键词：禽流感ELISA诊断禽流感（AvianInfluenza，AI）是由A型流感病毒所引起禽类的感染和/或疾病综合征，1878年首次发生于意大利，目前已在全世界广泛流行，被国际兽疫局确定为A类传染病。禽流感病毒感染后引起的临床症状和病理变化，因感染禽的种类、年龄、免疫状况、继发或混合感染状况、病程长短及感染毒株的毒力等不同而异，易与多种禽类疫病相混淆。因此，诸多高致病性禽流感病毒感染致人死亡的事件使禽流感的防制工作提升到前所未有的公共卫生学高度。禽流感疫情的多样性和公共卫生学意义，使得禽流感的早期、快速诊断对于疫病的控制尤为重要，传统的鸡胚分离、琼脂扩散试验、血凝抑制试验（HI）等检测禽流感的方法，由于敏感性不高或检验时间较长，不能满足基层检疫和疫病防制的需要，因此禽流感的确诊必需依赖实验室诊断。ELISA检测技术以其高敏感性、高特异性、经济、简便的特点，在畜禽疫病诊断和监测中发挥了重要作用。1间接ELISA1.1基于全病毒的间接ELISA黄金海等[1]应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的禽流感病毒（H9N2亚型AIV）经处理后作为ELISA检测方法的包被抗原。并以不同的含量进行包被，建立了定量检测禽流感抗体水平的间接ELISA方法。该试验建立的ELISA方法不仅可检测出血清中禽流感抗体的P/N值，还可用回归方程算出ELISA效价，实现定量测定，这为检测鸡群的抗体水平，制定合理的免疫程序提供了科学的依据。1.2基于核蛋白（NP）的间接ELISA禽流感核蛋白具有有型特异性，同型流感病毒核蛋白氨基酸具有很高的同源性，因而纯化重组蛋白可以用来代替全病毒作为ELISA的诊断抗原。用重组核蛋白作为抗原克服了常规全病毒抗原的许多不利之处，整个生产过程中不涉及禽流感病毒，因此生物安全性好，不存在散毒的危险，而且生产成本低，易于规模化生产。李海燕等[2，3]用表达禽流感病毒（AIV）核蛋白基因的杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，以其表达产物制备抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（rNP_ELISA）。根据对140份SPF鸡血清检测结果的统计分析，确定其判定标准为OD值大于0.15的血清样品为阳性。用rNP_ELISA检测150份SPF鸡血清、194份非免疫鸡血清及30份其它15种鸡疫病阳性血清均为阴性；检测A型AIV的15个不同亚型（H1-H15）毒株的特异性血清均为阳性；对人工接种AIV的SPF鸡第3d即能检出抗体，到第162d试验结束时检测仍为阳性。对3138份鸡血清进行监测，rNP_ELISA与全病毒间接ELISA（AIV_ELISA）、琼脂扩散试验（AGP）及血凝抑制试验（HI）的符合率分别为99.9%、97.1%、98.8%；并能100%检出AGP阳性及疑似、HI阳性的血清样品。试验证明，rNP_ELISA是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速、经济的血清学诊断技术。其并将成熟的禽流感间接ELISA快速诊断技术试剂盒化，该试剂盒与进口禽流感间接ELISA诊断试剂盒对同样血清样品检测，符合率为100%。吴仁蔚等[4]以AIV的H9N2亚型全长NP蛋白为包被抗原，建立了检测AIV抗体的间接NP-ELISA方法。对263份待检血清（包括临床收集的243份血清和20份H9N2亚型AIV免疫鸡阳性血清）进行检测，NP-ELISA与琼脂免疫扩散试验（AGP）的总符合率为83.3%，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为92%。异性试验表明，NP-ELISA方法可以检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体，检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实NP-ELISA最早可以检测鸡感染后7d的血清样品，并于感染后10d确定100%血清阳性，而AGP检测直到首免后21~28d才出现部分血清阳性，HI检测直到10~14d才出现部分血清阳性，并且NP-ELISA要比HI敏感4~40倍。将禽流感病毒核蛋白（NP）主要抗原域的基因片段（984bp）进行表达纯化，用纯化的重组蛋白作为包被抗原包被酶标板，建立的检测禽流感病毒抗体的间接ELISA方法能够区分携带H5N1禽流感病毒血凝素、神经氨酸酶和鸡白介素-18基因的禽痘病毒活载体疫苗免疫的免疫抗体和AIV全病毒免疫的抗体或自然感染抗体[5]。因此，此方法可以作为该活载体疫苗的一种配套检测方法，区分该活载体疫苗免疫抗体和其他疫苗免疫抗体。以核蛋白（NP）为包被抗原建立的间接ELISA是检测AIV血清型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。此技术不仅克服了以全病毒为包被抗原带来的危险，而且还可以区分活载体疫苗和其他疫苗免疫的区别，但是，不能区别灭活疫苗和自然感染所产生抗体。1.3基于血凝素（HA）的间接ELISA血凝素是位于病毒囊膜表面的一种蛋白质，具有亚型特异性，可以诱导特异性抗体的产生。因此，利用HA蛋白作为包被抗原，可以直接鉴定到亚型，省时、省力、节约资源。将H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因扩增、表达、纯化后作为抗原包被酶标板建立的检测H9亚型禽流感抗体的间接ELISA方法，特异性好，与H5、H7亚型禽流感标准阳性血清没有交叉反应，同时与鸡其他疫病的标准阳性血清呈阴性反应[6]。敏感性检测表明其阳性符合率、阴性符合率及总符合与进口试剂盒检测结果相比均为100%。说明以HA重组蛋白作为诊断H9亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，可用于H9亚型禽流感抗体的检测。1.4基于非结构蛋白（NS1）的间接ELISANS基因编码2种蛋白质，即NS1和NS2，其中NS1蛋白在病毒复制及早期的抗病毒免疫应答中具有重要作用。Skehel进一步研究表明，NS1蛋白在病毒复制的早期就大量表达，仅出现于病毒感染的细胞内，且能诱导机体产生针对NS1蛋白的抗体。这提示NS1蛋白可作为一种鉴别诊断标志，通过检测抗NS1蛋白的抗体来区分野毒感染和疫苗免疫，并可作为早期感染的依据。杨涛等[7]采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒（H5N1）的NS1基因，以经过纯化的融合蛋白MBP-NS1蛋白为包被抗原，初步建立了间接ELISA检测方法，试验证明融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应，而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。这为今后建立完善的区分疫苗免疫与自然感染动物的ELISA鉴别诊断方法奠定了基础。分别以AIVA/goose/Guangdong/2000（H5N1）的NS1蛋白和H5N2亚型禽流感病毒的NS1蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法，检测人工感染AIV和灭活疫苗免疫的SPF鸡血清，结果前者为阳性，后者为阴性[8，9]。表明该方法能区分活毒感染和灭活疫苗免疫鸡群，但不具有亚型特异型，具有A型流感的特异性。NS1-ELISA方法的初步应用，不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法，为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。2双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）肖运才等[10]以禽流感病毒（AIV）湖北分离株（H9N2亚型）提纯物为免疫原，制备出鸡抗AIV和兔抗AIV抗体。以纯化的鸡抗AIVIgG为包被抗体，兔抗AIVIgG为第2抗体，建立了检测AIV抗原的夹心ELISA法。结果表明，对已知的阳性样品，用夹心ELISA法测得的病毒滴度比血球凝集滴度高16倍以上，且能检出其它亚型的禽流感病毒；与其他禽类传染病病毒均无交叉反应，说明本方法有很高的特异性及敏感性。罗青平等[11]以单克隆抗体2H4为捕获抗体包被酶标板，以纯化的兔血清为第2抗体，建立了快速检测AIVH5N1抗原的双抗体夹心ELISA方法。试验证明该方法对AIV的检测灵敏度达4.5μg/ml，并与禽流感诊断金标准鸡胚分离鉴定作对比，结果显示DAS-ELISA方法与鸡胚分离鉴定符合率达98.2%；并且与其他亚型及禽类常见病毒性疾病无交叉反应。说明该方法具有简单、快速、敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于禽类群体AIVH5N1感染的早期检疫、实验室诊断的标准化及流行病学调查。肖丹、王晓华等[12，13]以相似的方法建立了检测H5亚型的双夹心ELISA方法，敏感性试、特异性检验表明，该种方法均较HI试验敏感，且与其他病毒无交叉反应。廖志勇等[14]以H5血凝素和携带H5全长基因的质粒免疫Balb/c小鼠制备mAb，通过筛选建立了以单克隆抗体H5M9为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记单克隆抗体H5M11为检测抗体的双抗体夹心ELISA；检测多株H5N1病毒和H5血凝素的最低检出值为1/32血凝单位，检测A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均为阴性。试验证明该方法是一种灵敏度高、特异性强的测定H5抗原的ELISA捕获法，可应用于禽流感病毒H5N1感染的实验室早期诊断。双抗体夹心ELISA方法的建立，病毒的检出，不仅为禽流感病鸡群的临床检验提供了一种方便、敏感、快速的检测方法，而且为开展流病学调查研究奠定了很好的基础，为最终控制和消灭这种疾病提供可靠依据和技术保证，具有很高的使用价值。3Dot-ELISA以混合纤维素酯微孔滤膜为固相载体，用自制的禽流感全病毒抗原和酶标抗体，建立了禽流感抗体斑点-ELISA检测法，出现明显清晰的斑点者判为禽流感抗体阳性。该方法对SPF鸡血清及新城疫、传染性法氏囊病等其它11种鸡疫病阳性血清均为阴性，对不同亚型特异性的禽流感病毒（AIV）分型血清、琼扩（AGP）阳性血清及血凝抑制（HI）阳性而AGP疑似的血清样品均呈阳性；对人工接种AIV的SPF鸡第3d即能检出抗体阳性，第5~117d可全部检出[15]。张春杰等[16]采用AIV灭活油乳苗（H9N2）对AIV非免疫鸡进行接种并获取高免血清，取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法，经过SephadexG25层析柱提纯后获得纯度很好的IgG。将IgG应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶（HRP），制备禽流感酶标抗体（IgG-HRP），建立了一种优化的AIV双抗夹心Dot-ELISA检测法。优化后的检测方法可在2.5h内诊断结果，制备好的包被膜在4℃下保存2个月不影响其效果。而且敏感性提高了3倍，与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应。Dot-ELISA采用混合纤维素酯膜或硝酸纤维素膜代替微量反应板，即保留ELISA方法的特异性、敏感性，结果又不需要特殊仪器分析，可肉眼判定，大大缩短了诊断时间。与间接ELISA法比较，不仅其特异性、敏感性、重复性相一致，而且结果可用肉眼判定，更适合现地禽流感抗体监测及流行病学调查。4抗原捕获ELISA宋建领等[17，18]采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体，研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法，用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。结果表明，采用高纯度的特异性多克隆抗体和单克隆抗体，建立的抗原捕捉ELISA，可排除正常鸡胚组织或尿囊液的本底干扰，具有良好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。王传彬等[19]用亲和层析法纯化抗禽流感病毒H5亚型血凝素单克隆抗体，包被微量反应板，用于捕获病毒抗原，再用生物素标记的单抗和酶标亲和素来检测病毒血凝素抗原。用该方法检测H1-H15亚型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株，并与血凝和血凝抑制试验比较，评价其敏感性和特异性。结果表明该ELISA反应体系能检出H5N3标准株和所有20株国内H5亚型AIV分离株，而与其他14个血凝素亚型的AIV标准株、15个H9亚型AIV分离株和2个H7亚型AIV分离株均无交叉反应。曹振等[20]以禽流感病毒（AIV）H5亚型分离株A/Chicken/GuangdongSZ/1/00（H5N1）作为免疫原，建立了通过生物素-亲和素放大系统的单抗-生物素捕获ELISA检测方法，取得了与王传彬[9]相似的试验结果。另外，采用H5（H7）亚型多克隆抗体（羊血清）作为捕获抗体，H5（H7）亚型HA特异性单克隆抗体为检测抗体纯化，建立了检测H5（H7）亚型禽流感病毒的抗原捕捉ELISA方法，和其他禽类病毒以及其他亚型禽流感病毒均没有明显的交叉反应性[21，22]，说明该方法对H5（H7）亚型高致病性禽流感病毒具有很好的特异性。5小结自1994年在广东省首次分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，先后在家禽体内分离获得了H5N1、H5N2（中国台湾）等多种禽流感病毒。中国香港、泰国、越南暴发的H5N1、H9N2亚型禽流感，出现了病毒突破种间屏障感染人的病例，赋予了禽流感全新的公共卫生意义。对于禽流感的防控措施，主要有2种形式，一种是采取以扑杀和生物安全方法为主的防控措施；另一种是采取扑杀、强制性免疫和生物安全方法相结合为主的扑灭措施，我国属于后者。因此，对于禽流感的及时监测、诊断，在禽流感的防控上就尤为重要。目前，对于禽流感的监控，主要是抗体的检测和病毒的分离两方面，ELISA是AI流行病学普查及早期快速诊断的一种有效和实用的方法。不同包被抗原的间接ELISA方法，不仅可以检测禽流感抗体水平，还可以进一步区分不同亚型病毒感染，疫苗免疫还是活病毒自然感染产生的抗体。双抗体夹心ELISA、抗原捕获ELISA方法的建立，自然感染病毒的查获，使得对于禽流感的诊断能进一步及早发现、能最大限度的缩小范围，及早控制疫情。Dot-ELISA的建立可以使检测工作在基层检疫部门更容易的推广进行，更有利于禽流感的时时监控。虽然目前国内建立了多种ELISA检测方法，但大多数还是停留在实验室研究阶段，完善的、商品化的ELISA检测试剂盒还没有很好的开发推广；对于建立ELISA检测方法的抗原、抗体、信号放大系统、干扰因素去除等方面还有不尽完善的方面，这些都还有待改进。参考文献1黄金海，王英珍，丁伯良，等.动物医学进展，2004，25（4）：111~113.2李海燕，于康震，辛晓光，等.中国预防兽医学报，2000，22（3）：182~185.3李海燕，于康震，辛晓光，等.中国预防兽医学报，2001，23（5）：372~376.4吴仁蔚，胡思顺，肖运才，等.畜牧兽医学报，2006，37（10）：1067~1072.5方忠意.H5亚型禽流感病毒核蛋白主要抗原域的表达及其间接ELISA方法的建立[硕士论文].郑州：河南农业大学，2006.6张瑞华，金梅林，王贵华，等.生物工程学报，2005，21（2）：315~762008年第6期Culture，2006，85：11~21.4RoyJK，LakshikumaranMS，BalyanHS，etal.BiochemGenetics，2004，42（1/2）：43~59.5MartinB，FriedrichUH，MelchingerAE.CropSci，1999，39：228~237.6VenkateswarluM，UrsSR，NathBS，etal.TreeGenetics&Genomes，2006，3：15~24.7CulleyTM，SbitaSJ，WickA.AnnalsofBotany，2007，100：91~100.8解新明，卢小良.草业科学，2005，2（22）：30~37.9蒋彩虹，王元英，孙玉合.中国烟草科学，2007，28（2）：1~5.10谢佳燕，张知彬.兽类学报，2004，1（24）：71~77.11BornetB，AntoineE，etal.JPhycol，2005，41：704~711.12SpagnuoloV，MuscarielloL，CozzolinoS，etal.PlantEcol，2007，188：91~101.13肖海峻，孟利前，李玉冰.内蒙古农业科技，2006（4）：31~33.14ChartersYM，Robe