AG490在膀胱癌中的抗癌效应及其机制

1/1AG490在膀胱癌中的抗癌效应及其机制AG490在膀胱癌中的抗癌效应及其机制作者：

姚林方，叶章群，陈志强，刘冠琳，孔德波，杨为民【摘要】目的观察JAK2激酶抑制剂AG490对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其抗癌机制。

方法应用不同剂量AG490处理膀胱癌细胞系BIU87，台盼蓝排斥试验检测细胞活力，噻唑蓝比色试验检测细胞增殖，克隆形成试验进一步检测膀胱癌细胞系干细胞对药物的敏感性，Hoechst33258/PI荧光双染检测细胞凋亡特征，流式细胞仪检测营细胞周期和凋亡，West吹ernblot检测pJ腽AK2、STAT3、p刊STAT3、CyclinD1、bclxL蛋白表沮达水平；并建立膀胱癌荷瘤≌模型，观察AG490体内钷抗肿瘤作用。

结果AG490明显抑制膀胱癌细胞增殖散和干细胞克隆形成，使细胞还周期阻滞，促进膀胱癌细胞肫凋亡；并可使pJAK2芸、STAT3、pSTA超T3、CyclinD1、┿bclxL蛋白表达水平明显下降。

裸鼠移植瘤在AミG490的作用下明显缩小。

结论AG490通过阻断STAT3信号通路，抑制镥膀胱癌细胞的增殖，促进其х调亡。

【关键词】膀胱洒癌；AG490；信号通路；抗癌效应TheMec慷hanismofAnti︼cancerEffectsofJanusKinaseInhibitorA穗G490inHumanB间ladderCancer龟Abstract：

ObjectiveToi茁nvestigatetheanticancere冱ffectsofJanu徘sKinasesele怊ctiveinhibit来orAG490inhumanbladderTh绸ebladdercanc卺ercelllineBI良U87wastreat菩edwithAG490i胄ndifferentdo泖ses.Thecellvitalityandproliferationw羸eredetectedb籴yTrypanBlues迤tainingrejec蒲tion,cellcou徘ntingandMTTa怊ssay.Drugsen缤sitivityofbl仰addercancers诂temcellstoAGⅩ490wasdetect枵edbyclonefor黹mationcounti伽ngassay.Fluorescencedyes妹tuffHoechst3ⅷ3258andPIdou诀blestaining骣assaywasused蜊toinvestigatethecellapoptosischaract锂eristics.Flo褪wcytometrywa镔sappliedtoan括alyzethecellcycleandapop憔tosis.Theexpressionsofph晾osphorylatio说nspecificJA趄K2(pJAK2),S肃TAT3,phosphorylationspe擂cificSTAT3(pSTAT3),Cycl均inD1andbclx━LweremeasuredbywesternA睽G490couldrem辁arkablyinhibittheprolifeСrationofbladdercancercel绥lsandtheform晌ationofthetumorstemcellc澡lones,blockt憬hecellcycle,炅facilitatetheapoptosisofbladdercance莫rcells,andre痔sultinlessex蹄pressionofpJAK2,STAT3,p瘫STAT3,CyclinD1andbclA班G490showedst╃rongabilitie苑sofinhibitin尹gtheprolifer敦ationofbladd叻ercancercell芫sandinducingthEirapoptos筋isthroughblo室ckingtheSTAT绪3signalingpathway.Keywo砜rds：

Bladderc粟ancer；AG490；黻Signalingpat岢hway；Anticancereffects0＊引言膀胱癌是我国泌尿系最常见的恶性肿瘤，发病率居泌尿系肿瘤首位，至今殖仍无特异的抗癌药物。

信号儇转导和转录激活因子3(S芭ignaltransdu饺cerandactiva汹toroftranscr芸iption3，STAT醣3)信号通路是当前细胞因嗪子研究领域的热点，该通路钮异常活化与细胞异常增殖和郄恶性转化密切相关。

而STAT3信号通路的异常活化棍源于JAK2激酶的异常激噻活[1]。

研究发现JAK锹2激酶抑制剂AG490可猾特异性阻断STAT3信号攉通路，抑制肿瘤细胞生长，备在白血病治疗方面显示良好⒈的抗肿瘤效应[2]。

我们利用体外细胞培养技术和体陶内移植瘤模型，观察了AGВ490对膀胱癌细胞增殖和邺凋亡的影响，了解AG49韩0在膀胱癌中的抗癌效应，骸并进一步探讨其抗癌机制。

钮1材料与方法材料少膀胱癌细胞系BIU8腴7购自武汉大学中国典型培武养物保藏中心，用含10%悒胎牛血清的完全RPMIト1640培养液，在37℃邈、5%CO2培养箱中培养醴。

氰基N苄苯乙烯钶胺(AG490)购自美国菇Calbiochem公司瞠。

胰蛋白酶、噻唑蓝(MT业T)、二甲基亚砜(DMSO)、双苯并咪唑染料(Hoechst33258)灵和碘化丙啶(PI)均购自肋美国SIGMA公司。

An荼nexinⅤFITC凋惶亡检测试剂盒购自晶美生物ヵ工程有限公司。

Westernblot采用一抗和碱御性磷酸酶标记的二抗。

BA辉LB/c裸小鼠(nu/n妞u)购自中科院上海实验动咏物中心，均为雄性，4～6韦周龄，体重18～22g。

方法台盼蓝排斥试葵验细胞经不同浓度AG翳490处理24、48和7糙2h后，制成单个细胞悬液ｒ，取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴%台盼蓝溶液の混匀，在3min内用血球计数板分别计数活细胞和死辞细胞数，活细胞率(%)=疴活细胞总数/(活细胞总数诃+死细胞总数)100%MTT法细胞接种傈于96孔板中，贴壁后无血ㄗ清培养24h，使细胞同步化。

按上述方法处理细胞，分别培养24、48和72h后，每孔加入MTT溶液舅20l，继续孵育4h，挂终止培养，吸尽孔内上清。

每孔加入150lDMS转O，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定570劁nm波长处光吸收值。

细胞刳抑制率=100%。

戕克隆形成试验制备单个璧细胞悬液，作梯度倍数稀释逸，按每皿300个细胞接种地于培养皿中，细胞同步化和竖AG490处理同前，更换榧完全培养液继续培养2周后＞，用PBS浸洗2次，甲醇碜固定后，加适量姬姆萨染色纩，浸洗干燥，计数克隆数。

做50个细胞以上的集落算一滦个克隆，克隆形成率=克隆呗数/接种细胞数100%啜Hoechst332郸58/PI荧光双染在际6孔板中铺板爬片，细胞同焕步化和AG490处理同前悄，加入Hoechst33锁258100l，37℃衬避光反应10min。

继续钾加入PI100l，4℃避光反应20min。

4%乖多聚甲醛固定细胞10min后，置于荧光显微镜下观濠察细胞形态结构及胞核的变贩化，每张玻片随机选择10仙个视野并计数，区分出坏死滔、凋亡和活细胞，并计算出篓凋亡率、坏死率及存活率。

撵细胞周期检测细胞接芒种于6孔板，细胞处理同上是，收集细胞，PBS洗涤，￥70%冰乙醇固定，PI染色，应用FACSort流脔式细胞仪进行检测，数据用橘美国BD公司CellQu花est细胞周期分析软件进钧行储存及分析。

细胞凋亡检测用4℃预冷的P暄BS洗细胞2次，用250啪l结合缓冲液重悬细胞，戒使其浓度为1106/m睁l。

取100l的细胞悬尹液于5ml流式管中，加入铑5lAnnexinⅤ苫FITC和10lPI溶觋液，混匀后于室温避光孵育缩15min，再加入400びlPBS，上流式细胞仪逐检测。

Western仄blot法参照美国Sa楠ntaCruz公司提供的蚓方法提取蛋白。

以Brad┼ford法作蛋白定量后，罨取50g蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，粽电转移至硝酸纤维素膜，3坌7℃封闭1h后，分别加入倘1∶1000稀释的一抗p痂JAK2、STAT3、pSTAT3、CyclinD1、bclxL后巷4℃过夜，加入碱性磷酸酶值标记的二抗检测杂交蛋白。

膊体内移植瘤抑制试验制备细胞悬液接种于裸鼠背部，每个部位注射(含5熬106个活细胞)，当瘤块婧成形，直径达～时，即将动镂物随机分组，对照组腹腔注︷射生理盐水，实验组腹腔注翠射AG490。

AG490每5mg用1mlDMSO+19mlddH2O充分溶解，每次腹腔注射10m精g/kg体重。

以上两组均蝣隔日注射1次，4天测肿瘤辫体积1次，用药21天颈椎参脱位处死裸鼠，完整剥离瘤体，分别称量瘤重。

计算瘤诿体积=长宽2，单位c入m3，抑瘤率(%)=(1用药组平均瘤重/阴性对馘照组平均瘤重)100%统计学处理数据以樯s表示，组间比较采用两样蜉本均数的t检验，应用统计徭软件包进行统计学分析。

镔2结果台盼蓝阳排斥试验和MTT实验结果闳见图1、2。

随着AG49ぉ0药物浓度增大和作用时间换的延长，BIU87细胞仿活力不断下降，AG490对细胞的抑制率不断增加，细胞增殖明显受到抑制，而錾相应空白对照组变化不明显衷，差异有统计学意义。

作用72h后，不同浓度(25嵛、50、100mol/澶L)的AG490对BIU贤87细胞的抑制率分别为堑%、%、%。

克隆形成恁试验进一步检测膀胱癌细胞虏系干细胞对药物的敏感性，爹见表1。

可见随着AG49⒋0药物浓度的不断增大，B荔IU87干细胞克隆数明丕显减少，克隆形成率从%降至%。

不同浓度(25、5颀0、100mol/L)筱的AG490对BIU8铢7细胞克隆形成的抑制率分艨别为%、%、%。

表1A枷G490对BIU87干互细胞克隆形成的影响与空弪白对照组比较，*P与空白辖对照组比较，*P流式细胞凋亡检测发现AG490眚明显促进BIU87细胞的早期凋亡，见表4。

10锵0mol/LAG490坭作用72h后，细胞早期凋影亡率由%增加至%，具有显肼著性差异。

表4流式细胞分析检测细胞早期凋亡与舵空白对照组比较，*P膀竿胱癌细胞接种于裸鼠皮下1谋周后，可见背部成形的瘤块耦，移植成功率为100%。

げAG490组与阴性对照组琨比较，其肿瘤生长速度显著煲减慢，见图4。

用药21天助后处死所有裸鼠，测抑瘤率个为%。

3讨论STAT3信号通路是调控细胞增抢殖、分化及凋亡的重要的细憨胞内信号通路。

JAK2作蕞为上游激酶活化后募集胞浆倍中的STAT3单体，使无活性的STAT3分子酪氨孟酸磷酸化而形成有活性的二嗬聚体，转移入细胞核，结合幡DNA，导致特定靶基因的钉开启[3]。

近年来研究发现，该通路持续激活可导致季细胞异常增殖和恶性转化，嚷参与了人类恶性肿瘤的发生迢、发展和演进[4]。

越来读越多的肿瘤细胞系和人类癌骷组织表达异常活化的STA楷T3蛋白[5]。

阻断该通ュ路成为肿瘤治疗的新靶点[训6]。

目前，已经发现AG醯490是该通路的特异性阻锹断剂。

AG490即富氰基N苄苯乙烯胺，是盗一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，分子式为C17H14N2O3，分子量为，结构类似酪氨酸赵，可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位点，是JAK2激沟酶抑制剂，可特异性阻断S棰TAT3信号通路[7]。

目前，AG490作为抗肿苓瘤药物已用于临床治疗白血髓病，特别是对JAK2异常剀活化导致的前B急性淋巴细膛胞白血病具有很好的治疗作篙用，同时毒副作用很小[2宝]。

在本实验中，我们应钚用AG490作用于膀胱癌⒛BIU87细胞后，细胞镜增殖速度明显减慢，显著抑菌制了膀胱癌细胞系干细胞的共克隆形成能力，细胞周期被乐阻滞于G1/S期，明显促客进膀胱癌细胞凋亡，显著抑搜制裸鼠移植瘤生长，抑瘤率惜高达%；并可使JAK2活唛化蛋白pJAK2和ST椠AT3蛋白及其活化蛋白p刨STAT3表达与活性明隆显下降，有效阻断了STA⒓T3信号通路的激活，最终郓使靶基因细胞周期关键粒调控基因cyclinD1俚和凋亡抑制基因BclxL的蛋白表达水平明显下降颦。

由此可见，AG490通呜过阻断STAT3信号通路铹，抑制细胞周期关键调控基系因cyclinD1的表达汐，明显抑制膀胱癌细胞的增⑷殖，阻断凋亡抑制基因bc蒌lxL的表达，促进膀胱砬癌细胞的调亡，但其具体作新用机制有待进一步研究。

总克之，AG490通过阻断S筘TAT3信号通路发挥抗癌阵作用，有望成为膀胱癌治疗缙的新型药物。

【参考文献】［1］Hebens逡trEitD，Horej赓sHoeckJ，Dus提chlA.JAK/STA稳Tdependentg绒eneregulatio踅nbycytokines醭［J］.DrugNews⒎Perspect，XX，18(4)：

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