etv1在胃肠道间质瘤中的特异性表达

1/1etv1在胃肠道间质瘤中的特异性表达ETV1在胃肠道间质瘤中的特异性表达【摘要】目的：

探讨ETV1在胃肠道间质瘤组织中的表达及临床意义。

方法：

应用免疫组化、实时荧光定量PCR、Western-blot检测ETV1在135例不同胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织及瘤旁组织中的表达。

结果：

免疫组化结果显示，ETV1在胃肠道间质瘤中阳性表达率为68.1%，显著高于瘤旁正常组织的5.2%（P0.05）。

荧光定量PCR方法显示，间质瘤组织中ETV1的相对表达Ct值（3.302.37）低于瘤旁正常组织的（6.192.86），肿瘤组织中ETV1的表达是正常组织的7.41倍，差异有统计学意义（P0.001）。

Western-blot法检测显示，ETV1蛋白在胃肠道间质瘤中的表达水平（1.240.67）也较瘤旁正常组织高（0.880.28）（P=0.0369）；Pearson相关分析显示，ETV1mRNA和蛋白水平呈正相关（r=0.526，P=0.017）。

结论：

ETV1在胃肠道间质瘤中特异性高表达，可能与胃肠道间质瘤的发生发展有关，有望成为新的肿瘤标志物，为临床治疗提供新靶点。

【关键词】胃肠道间质瘤；转录调控因子；肿瘤发生【Abstract】Objective：

ToinvestigatetheexpressionofETV1ingastrointestinalstromaltumorsanditsclinicalsignificance.Method：

Surgicalgastrointestinalstromaltumortissuesandadjacentnormalmucosawereobtainedfrom135patientswithgastrointestinalstromaltumor.ImmunohistochemistrywasconductedtodetectthedistributionofETV1protein，whilethequantitativereal-timereversetranscriptasepolymerasechainreactionandWesternblotmethodwereusedtodetecttheexpressionsofETV1mRNAandprotein.Result：

ImmunohistochemicalanalysisshowedthepositiverateofETV1expressionwas68.1%ingastrointestinalstromaltumortissues，itwassignificantlyhigherthan5.2%intheadjacentnormalsamples（P0.05）.Fluorescencequantitativepolymerasechainreaction（PCR）showedthatrelativeexpressionofCtvaluewas（3.302.37）ingastrointestinalstromaltumortissues，itwassignificantlylowerthan（6.192.86）inadjacentnormalsamples，expressionofETV1intumortissuewas7.41timesofnormaltissue，thedifferencewasstatisticallysignificant（P0.001）.WesternblotanalysisrevealedthattheexpressionofETV1proteinwas（1.240.67）ingastrointestinalstromaltumortissues，itwassignificantlyhigherthan（0.880.28）innormalcolorectaltissues（P=0.0369）.PearsoncorrelationanalysisshowedthatthemRNAlevelwasinpositivecorrelationwiththeproteinlevel（r=0.526，P=0.017）.Conclusion：

ThespecificexpressionoftheETV1isinacorrelationwiththepathogenesisofgastrointestinalstromaltumor.ETV1isexpectedtobeanewtumormarkerandthenewtargetforclinicaltherapy.【Keywords】Gastrointestinalstromaltumor；Transcriptionregulatoryfactors；TumorigenesisFirst-authorsaddress：

TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangUniversityMedicalCollege，Hangzhou310000，Chinadoi：

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.001ETS家族是最大的信号依赖转录调控因子家族之一，其过度表达和许多人类肿瘤发生有关，近年来已成为各国学者关注的重点。

ETS变异体1（ETV1，ER81）是ETS家族成员之一。

已有研究表明，ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中过度表达，参与肿瘤的形成和发展[1-5]。

国外已有研究发现，ETV1在胃肠道间质瘤（gastrointestinalstromaltumor，GIST）细胞中存在普遍高表达[6]，但是国内鲜有相关报道。

本实验采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和Western-blot方法检测GIST及瘤旁正常组织中ETV1的表达，探索其表达差异的意义。

1材料与方法1.1标本来源选取本院2012年5月-2014年1月经手术治疗的GIST患者135例。

其中男68例，女67例，年龄24～83岁，平均（58.711.8）岁，中位年龄59岁。

肿瘤发生部位包括胃104例，小肠24例，其他部位7例。

所有手术病例均为初治，术前均未行放、化疗或伊马替尼等分子靶向治疗。

GIST标本取自病灶中央无坏死部分，另取距肿瘤边缘大于3cm的瘤旁正常组织，离体后立即切成大约0.5cm小块，于10min内放于液氮中保存，后转存于-80℃冰箱。

部分标本用4%甲醛固定，石蜡包埋，做免疫组化染色。

所有标本均经过病理科医师证实为GIST。

本实验获得医院伦理委员会同意。

1.2免疫组化染色组织石蜡包埋制成厚约4m组织切片，常规HE染色和免疫组化染色。

每批染色均用已知阳性切片做阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。

结果判定：

以胞质、胞核或胞膜染有均匀棕黄色颗粒、染色强度高于背景非特异性染色者为阳性细胞。

采用双盲法，选取5个高倍视野进行计数。

按半定量评分方法进行计算：

根据每视野着色细胞占总细胞的数目（阳性细胞0、1%～25%、26%～50%、50%）分别记为0、1、2、3分；按每张切片着色细胞的染色强度（阴性、弱、中、强）分别记为0、1、2、3分；根据两项评分之和判断结果：

2分为阴性，3为阳性。

1.3RT-PCR检测ETV1mRNA表达1.3.1总RNA提取称取100mg组织，匀浆后用TRIzol法进行GIST组织及瘤旁组织的总RNA提取。

紫外分光光度计定量并检测其纯度，A260/A280比值在1.8～2.0。

按照TakaraPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）试剂盒（Takara公司）说明书步骤将其逆转录为cDNA。

1.3.2实时荧光定量PCRETV1正向引物为5-GCAGTCAAGAACAGCCCTTTA-3，反向引物为5-TCAGGTTTCGGTGTATGAGTTG-3。

以GAPDH为内参照，其正向引物为5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，反向引物为5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3。

取cDNA1L，按照SYBR?PremixExTaq?（TliRNaseHPlus）试剂盒（Takara公司）说明书步骤进行反应，95℃预变性30s，随后进行40个循环的PCR扩增反应（95℃变性5s，60℃退火与延伸34s）。

肿瘤组织与正常组织的相对表达Ct值，即?Ct=Ct（ETV1）-Ct（GAPDH）。

肿瘤组织中ETV1表达相对于瘤旁正常组织的倍数用2-??Ct计算。

1.4Westernblot法检测ETV1蛋白表达取100mg新鲜组织，将组织粉碎后加入裂解液提取总蛋白，4℃离心10min，提取上清液，BCA法测定蛋白含量。

在提取出的蛋白中加入适量5上样缓冲液煮沸10min。

取等量样本于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分离，电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）。

5%脱脂牛奶室温封闭2h，与兔抗人ETV1单克隆抗体或GAPDH单克隆抗体4℃孵育过夜，洗膜，与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔多克隆抗体室温孵育1h，洗膜。

用ECL显色曝光。

组织中不同蛋白表达水平用目的条带与内参GAPDH条带的灰度值比值定量表示。

1.5统计学处理采用SPSS19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（xs）表示，比较采用t检验和单因素方差分析，计数资料用率表示，采用字2检验，Kruskal―Wallis等级相关采用Spearman方法，以P0.05为差异有统计学意义。

2结果2.1ETV1的免疫组化染色结果ETV1免疫组化阳性染色产物位于细胞核。

ETV1在GIST中普遍高表达，阳性率达68.1%（92/135），但是在瘤旁正常组织基本不表达，为5.2%（7/135），差异具有统计学意义（P0.05），见图1。

3讨论GIST是消化系统最常见的间叶源性肿瘤，它主要是由c-kit或者PDGFRA基因致瘤突变导致，发病率约为1/10万～2/10万人，近年来呈明显增加的趋势。

伊马替尼等分子靶向药物的应用，极大地提高了GIST的药物疗效。

但是，伊马替尼的成功应用并未根除间质瘤，肿瘤复发和耐药成为影响疗效的关键因素[7-8]。

因此，探索GIST表面分子特性，寻找新的分子靶标已成为目前GIST诊治研究的热点。

ETS家族是最大的信号依赖转录调控因子家族之一，现已发现30多个ETS家族成员，它们均含有一个由85个氨基酸组成的特异DNA结合区（ETS区），该区与靶基因启动区一个富含嘌呤的序列GGAA/T结合后调节基因转录。

ETV1是ETS家族成员之一，ETV1及其相关ETS转录因子可以调控多能祖细胞分化，在组织发育过程中差异表达，过度表达促进细胞恶性改变[9-10]。

在一些肿瘤中ETV1基因参与某些染色体易位突变，基因融合产生嵌合体蛋白导致细胞恶性变，被认为是促使肿瘤发生的主要因素之一，如前列癌中ETV1和跨膜丝氨酸蛋白酶2基因的融合、尤文氏肉瘤中ETV-1和EWS基因的融合[1，5]。

前列腺癌中过度表达的ETV1也可以和雄激素受体作用促成肿瘤的侵袭与转移[11]。

其他肿瘤如黑色素瘤、乳腺癌中也存在ETV1蛋白过度表达，在调控肿瘤细胞增殖中起重要作用[2-4]。

进一步研究表明，ETV1对靶基因的作用由复杂的调控网络进行调节。

各种信号激活Ras/Raf/MAPK信号通路是调控ETV1的主要途径[2，12-13]。

Ras/Raf/MAPK通路的激活导致ETS转录因子活化，从而调控生长和周期相关基因，如c-myc、junB、cdc2和cyclinD139[14]。

在ETS的参与作用下，Ras信号成功转化成一系列生长、凋亡相关基因。

在前列腺癌、黑色素瘤中，Ras-MAPK-ETV1通路进一步得到了验证，Ras-MAPK的激活是调控ETV1的主要途径[2，12-13]。

Chi等[6]研究发现，ETV1在伊马替尼敏感或耐药GIST细胞中普遍表达，且ETV1在GIST中的表达水平明显高于其他肿瘤，如胃癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。

ETV1能够与KIT协同作用，调控GIST细胞的增殖凋亡与恶性转变。

本研究结果表明，ETV1在GIST组织中的基因和蛋白表达水平均显著上调，在瘤旁正常组织很少表达，与Chi等[6]研究结果符合。

该结果提示ETV1在GIST中特异性表达，可能与肿瘤的发生发展具有相关性。

但是否将ETV1的表达作为评估肿瘤恶性程度及预测发展仍有待进一步研究。

深入探索ETV1在GIST发生发展中的可能作用机制，将为GIST的诊治提供新的思路。

参考文献[1]Ord?ezJL，OsunaD，HerreroD，etal.AdvancesinEwing’ssarcomaresearch：

wherearewenowandwhatliesahead？[J].CancerRes，2009，69（18）：

7140-7150.[2]Jan-ValbuenaJ，WidlundHR，PernerS，etal.AnoncogenicroleforETV1inmelanoma[J].CancerRes，2010，70（5）：

2075-2084.[3]BakerR，KentCV，SilbermannRA，etal.Pea3transcriptionfactorsandwnt1-inducedmousemammaryneoplasia[J].PlosOne，2010，5（1）：

e8854.[4]VageliD，IoannouMG，KoukoulisGK.TranscriptionalactivationofhTERTinbreastcarcinomasbytheHer2-ER81-relatedpathway[J].OncolRes，2009，17（9）：

413-423.[5]OhS，ShinS，JanknechtR.ETV1，4and5：

anoncogenicsubfamilyofETStranscriptionfactors[J].BiochimicaetBiophysicaActa，2012，1826（1）：

1-12.[6]ChiP，ChenY，ZhangL，etal.ETV1isalineagesurvivalfactorthatcooperateswithKITingastrointestinalstromaltumours[J].Nature，2010，467（7317）：

849-853.[7]DuffaudF，BlayJY.Gastrointestinalstromaltumors：

biologyandtreatment[J].Oncology，2003，65（3）：

187-197.[8]BraconiC，BracciR，CellerinoR.MoleculartargetsinGastrointestinalStromalTumors（GIST）therapy[J].CurrCancerDrugTargets，2008，8（5）：

359-366.[9]KurpiosNA，MacNeilL，ShepherdTG，etal.ThePea3Etstranscriptionfactorregulatesdifferentiationofmultipotentprogenitorcellsduringmammaryglanddevelopment[J].DevBiol，2009，325（1）：

106-121.[10]DeLaunoitY，BaertJL，Chotteau-LelievreA，etal.TheEtstranscription