PCR技术的研究与现状分析课程论文

PCR技术的研究与现状分析摘要：PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，该技术已经广泛地应用于水产、微生物检测、临床微生物、基因表达、肿瘤免疫、微小残留病变的检测，DNA拷贝数的测量、基因组变异和多态性等许多方面。本文主要介绍4种PCR技术及其在各个领域的应用现状。关键词：PCR技术；分类；研究现状；应用；ResearchandApplicationStatusofPCRTechnologyClass1Bio-engineering10Student:LaoYangyanStudentID:1031250019Tutor:WeiDongmeiAbstract:PCRisaninvitroenzymaticsynthesis，amplificationofspecificDNAfragment.Becauseofitshigh-strengthspecificityandsensitivity，detectionspeedandgoodaccuracy，ithasbeenwidelyappliedinmanyfieldssuchastheaquatic，microbialdetection，clinicalmicrobiology，geneexpression，tumorimmunology，detectionofminimalresiduallesion，measurementofDNAcopynumber，genomemutation，polymorphismandsoon.Thisarticlesummarize4kindsofPCRtechnology，withitsapplicationstatusisanalysed.Keywords:PCRtechnology；Category；Progressresearch；Application引言聚合酶链反应(PCR)技术问世20多年以来,已经在生物学研究领域内得到了巨大的发展并不断的完善,不仅广泛应用在基础研究领域,在疾病诊断等方面也有了越来越广泛深入的研究和应用。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并且由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、单分子PCR技术、变性梯度凝胶电泳技术。目前应用最多的为荧光定量。本文主要介绍4种PCR技术及其在各个领域的应用现状。并对PCR的前景进行了展望，让其更好的服务于人们的生活。PCR技术原理PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列（模板）在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[3]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00~200万倍。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。PCR技术的分类在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。2.1实时荧光定量PCR技术1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[4]。荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[5]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[6]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[7]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[8]。2.2多重PCR技术多重PCR（mutiplexPCR）技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[9]。在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[10]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[11]。2.3单分子PCR技术（SM-PCR）单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[12]。单分子PCR技术反应中，DNA模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[13]。由于单分子PCR技术反应的变性温度（96~98℃）大多比常规PCR技术（94℃）略高，因而对DNA聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间（5~15s）、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术。2.4变性梯度凝胶电泳PCR技术(DenaturingGradientGelElectrophoresis)PCR-DGGE技术是基于核酸序列的不同，将片段大小相同的DNA序列分开的一种技术方法[14]。在进行变性梯度凝胶电泳时，序列不同的DNA片段因为碱基组成和排列的差异，在聚丙烯酰胺凝胶中解链时需要不同的变性剂浓度，并会发生空间构型的变化，最终导致电泳迁移率的差异。将通过PCR扩增之后得到的等长双链DNA分子，在含梯度变性剂(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，电泳迁移率的差异会使不同序列的DNA片段停留在凝胶的不同位置，从而形成相互分开的条带图谱[15]。从理论上讲,只要选择的电泳条件足够精细,就可以分开仅有1个碱基差异的DNA片段[16]。PCR技术的应用3.1PCR技术在水产上的应用基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-timePCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[17]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据[18]。孙淑娜等研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyeretal以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。3.2PCR技术在食品微生物检测中的应用实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，除了具有常规PCR的快速、灵敏、操作方便等特点外，还具有以下优点：全封闭反应，无需凝胶电泳等PCR后处理，减小对环境的污染；不使用有毒试剂，操作安全；定量准确；仪器在线实时监测，结果直观。多重PCR技术是通过对普通PCR技术的改进而建立起来的一种技术，是将多条引物和多条模板混合在一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带，或者多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片断，常用于对超长片断的扩增。与常规的PCR相比，还具有扩增效率高、产物特异性高和经济简便等特点，特别适合食品中多种致病菌的快速检测。PCR-DGGE技术具有可检测不可培养类细菌、检测时间短、检测率高、重复性好等优点。近些年来，此技术在食品中检测微生物后应用也有报道。3.3PCR技术在临床微生物中的应用许多传染病的特点是具有高度的变异率，这会严重影响对致病菌的评估，分子信标可以用于病原菌的定量。它的优点是:一个没有荧光的淬灭物可以用于4个不同的荧光染料，这样就可以同时检测和定量4个样本。在许多应用领域需要同时对多个核酸进行定量，这将大大降低检测的花费和所需的时间。这个方法的另一个好处在于加样的误差被最小化了，而且所有核酸都是在相同的条件下同时扩增，这样它所获得的数据就更加精确可靠。当然，多通道检测比单通道检测更为复杂也需要解决可能出现的更多问题。广东省花都市人民医院、中山医科大学基因诊断中心采用荧光定量PCR检测技术对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒等5个项目进行了定量测定，结果表明定量PCR方法可靠性和重复性好，且操作简便、快速，结果判断客观。除此以外，目前已有用此方法对人类免疫缺陷病毒，肝炎病毒，结核杆菌，巨细胞病毒，EB病毒，流感病毒A、B等病原体进行检测的报道。3.4PCR技术在畜牧兽医领域的应用家育DNA多态性研究是近年来兴起的分子水平遗传标记选择技术,对于开展品种问遗传差异程度、种群间亲缘关系、个体问遗传相似性,亲子鉴定等方面的工作,对于开展数量性状的间接选择,早期选择,提高数量性状选择效率等研究均具有重要的意义和潜在的应用价值。PCR技术的出现大大推动了上述研究的进程。以PCR技术为基础的DNA多态性分析和检测技术,如PCR-RFLP(限制性长度多态性),PCR-SSCP(多聚酶链反应产物的单链构象多态性)和AFLP(扩增片断长度多态性)等,已经在猪DNA多态性研究中得到了应用,并且有可能迅速推广到育种实践中去。3.5PCR技术在转基因食品检测中的应用转基因食品，是利用基因工程技术将有利的基因转移到微生物,，植物或动物细胞内，使他们获得有利的特性，再由这些转基因物种生产或处理获得的食品及添加剂。由此可增加食品的种类，提高产量，改进营养成分的构成，延长货架期等，目前，转基因作物及其产品的安全性问题越来越引起消费者的重视[25]。为了保护人类的健康，世界卫生组织在20世纪90年代提出了对转基因食品进行安全性评价的要求，对食品中的GMOs存在与否进行标示。因此，对食品中的GMOs进行监测，建立安全性检验的技术与方法，成为管理和审批工作的重要基础。在众多的监测方法中，PCR是最常用以及最适用的监测转基因食品的方法。PCR方法中，常用的几个特定序列分为三类：1、调控序列：他们调节转入植物的基因的表达。由于大多数转基因食品的基因都含有CaMV35S启动子和NOS终止子，因此，在检测食品中是否含有GMOs时，可以直接检测CaMV35S启动子和/或NOS终止子的存在与否，如果存在，即可说明其中存在GMOs。2、标记序列，用于帮助在遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞，组织和再生植株，一般是抗生素抗性基因。3、目的基因，即转入的基因，如抗虫、抗除草剂基因。用PCR方法鉴定植株中检出的目的基因，标记基因，报告基因，35S，NOS等外源基因片段，为转基因食品的筛选鉴定及为安全性评价提供敏感直接的数据，成为转基因食品安全性检验中一项重要的技术手段。PCR技术的应用前景展望传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用；多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中将具有重要作用。未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面。随着研究的不断深入发展与完善，许多相关的新类型及改良的PCR技术将会不断涌现，这些派生出的新类型和新方法必将在未来食品检测中有非常好的应用前景。参考文献:[1]常世敏,PCR在食品微生物检测中的应用[J].邯郸农业高等专科学校学报,2004,21（4）:23-25.[2]唐永凯,俞菊华,徐跑,等.实时荧光定量PCR技术及其在水产上的应用[J].中国农学通报,2010（21）:422-426.[3]谢海燕.黑线仓鼠LHR部分序列克隆及组织器官的表达差异[D].曲阜：曲阜师范大学，2011.[4]KUBISTAM,ANDRADEJM,BENGTSSONM,eta1.Thereal-timepolymerasechainreaction[J].MoLecularAspectsofMedicine,2006,27（2-3）:95-125.[5]AGINDOTANBO,SHIELPJ,BERGERPH.Simultaneousdetectionofpotatoviruses,PLRV,PVA,PVXandPVYfromdormantpotatotubersbyTaqManreal-timeRT-PCR[J].JVirolMethods,2007,142（1-2）:l-9.[6]薛霜,独军政,高闪电,等.实时荧光定量PCR技术研究进展及其在兽医学中的应用[J].中国农学通报,2010（7）:11-15.[7]SCHUBERTJ,FOMITCHEVAV,SZTANGRET-WISNIEWSKAJ.DifferentiationofPotatovirusYstrainsusingimprovedsetsofdiagnostic-PCR-primers[J].JVirolMethods,2007,140（1-2）:66-74.[8]袁继红.实时荧光定量PCR技术的实验研究[J].现代农业科技,2010（13）:20-22.[9]朱善元.生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用[J].黑龙江畜牧兽医,1999（11）:21-22.[10]银花,胡晓湘,李宁,等.影响多重PCR扩增效果的因素[J].遗传,2003,25（1）:65-68.[11]陈诺,唐善虎，岑璐伽，等.多重PCR技术在食品微生物检测中的应用进展[J].生物技术,2010,37(10):72-75.[12]刘连生.常规PCR技术与单分子PCR技术[J].医学信息,2010,23（11）:4379-4380.[13]顾超颖.汗孔角化病的临床分析,SSH1、ARPC3