植物生理学-实验3-NR活性测定

实验二问题分析气孔密度（单位）：固定法比印迹法多气孔大小（开度）：Na+可以代替K+，但效果较差取样时间、位置及照光时间实验三硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶活性的影响

硝酸盐还原硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitratereductase)催化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。诱导酶(inducedenzyme)

植物体本来不含有，但在特定的外来物质(如底物)的影响下诱导形成的酶NR基因表达的调控实验证明NO3-能诱导NR的表达NO3－的还原在根或叶中均可进行NO3－供应少时，主要在根中还原NO3－供应量大而根中还原力不足时，NO3－运到叶片进行还原亚硝酸盐还原为氨亚硝酸还原或在根中的前质体，或在叶中的叶绿体中进行。还原所需的电子来自还原态的铁氧还蛋白。NO3-还原为NO2-后，NO2-被迅速运进质体即根中的前质体或叶中的叶绿体，并进一步被亚硝酸还原酶（NiR）还原为NH3或NH4+。叶绿体叶绿体中，还原反应所需的一对电子由还原态铁氧还蛋白提供一实验目的理解硝酸还原酶的特性；

掌握硝酸还原酶活性测定方法。

实验原理NR是诱导酶，在取样前一天用50mMKNO3-

或NaNO3-加到培养苗的水中以诱导硝酸还原酶的产生。NO2-产生

NO3-

+NADH++

H+→NO2-

+NAD++H2O

外界溶液中的NO3-渗入植物组织后，经硝酸还原酶作用，所产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中；测定反应溶液中NO2-含量的增加，即表现该酶活性的大小。在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO2-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中磺胺与NO2-形成重氮盐，再与α-萘胺偶联形成红色的偶氮化合物，可用分光光度计在540nm下比色测定。NH2NO2-含量测定NO2-含量测定当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成直线关系。NO2-含量标准曲线：[NO2-]

（µMol/ml）=0.0026＋0.359OD540

硝酸还原酶活性测定NR酶活性（NO2-µMol/h•gfw）=[NO2-]×10ml/1ml÷（鲜重g×0.5h）三材料与方法两种处理的小麦材料[水（W），KNO3（N）]A液磷酸缓冲液：水：DNP溶液：蔗糖溶液＝5：5：1：1B液磷酸缓冲液：KNO3：DNP溶液：蔗糖溶液＝5：5：1：1磺胺试剂α-萘胺试剂四实验步骤两种材料[水（W），KNO3（N）]各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、擦干，剪成0.5cm小段，各称取0.3克两份；将两份（W、N）叶段分别置于含有10mlA、B溶液的两只试管中，即WA、WB，NA、NB四管(每个试管塞蓝色纱网)；将试管放在真空干燥器中抽气0.5h，放气后摇晃直至叶段沉于溶液中；将试管置于25-30℃温箱中黑暗保温0.5h；取四支试管，标号为WA´、WB´，NA´、NB´，分别吸取1ml对应反应液，各加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂（注意顺序），混合摇匀，25℃水浴5min，取出室温静置25min。再取两支试管分别取A液或B液1ml代替反应液，各加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂。设空白对照管在540nm测定吸光值。表硝酸还原酶的活性处理A液B液吸光度吸光度ODB-ODANR活性

H2OKNO3结果记录、计算[NO2-]（µmol/ml）=0.0026＋0.359OD540酶活性（NO2-

µmol/h•gfw）=[NO2-]×10ml/1ml÷（鲜重g×时间h）六思考题为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进