大学生物化学第10章 复制课件

DNA的生物合成(复制)DNABiosynthesis，Replication

第十章大学生物化学第10章复制复制（replication）是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA大学生物化学第10章复制复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication

第一节大学生物化学第10章复制复制的方式——半保留复制（semi-conservativereplication）复制的高保真性（highfidelity）双向复制（bidirectionalreplication）半不连续复制（semi-discontinuousreplication）大学生物化学第10章复制一、半保留复制的实验依据和意义DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板（template）按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念大学生物化学第10章复制AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

目录大学生物化学第10章复制子链继承母链遗传信息的几种可能方式

全保留式半保留式混合式大学生物化学第10章复制密度梯度实验

——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果大学生物化学第10章复制按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。大学生物化学第10章复制原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。二、双向复制复制中的放射自显影图象大学生物化学第10章复制A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC大学生物化学第10章复制真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。大学生物化学第10章复制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’大学生物化学第10章复制三、复制的半不连续性3

5

3

5

解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链（laggingstrand）大学生物化学第10章复制顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段（okazakifragment）。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

大学生物化学第10章复制

DNA复制的酶学TheEnzymologyofDNAReplication第二节大学生物化学第10章复制参与DNA复制的物质底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):

解开成单链的DNA母链引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子大学生物化学第10章复制一、复制的化学反应

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

目录大学生物化学第10章复制聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3

方向进行。大学生物化学第10章复制二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）简称：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性大学生物化学第10章复制5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。

核酸外切酶活性目录大学生物化学第10章复制（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ大学生物化学第10章复制（一）原核生物的DNA聚合酶大学生物化学第10章复制功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）大学生物化学第10章复制323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

大学生物化学第10章复制DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。

大学生物化学第10章复制功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)大学生物化学第10章复制（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

大学生物化学第10章复制（二）真核生物的DNA聚合酶大学生物化学第10章复制三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读

（二）复制的保真性和碱基选择大学生物化学第10章复制（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。大学生物化学第10章复制（二）复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

大学生物化学第10章复制1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制

大学生物化学第10章复制四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

大学生物化学第10章复制（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白大学生物化学第10章复制E.Coli基因图目录大学生物化学第10章复制解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

大学生物化学第10章复制108

局部解链后（二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

大学生物化学第10章复制解链过程中正超螺旋的形成目录大学生物化学第10章复制拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类大学生物化学第10章复制拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制

大学生物化学第10章复制目录大学生物化学第10章复制五、DNA连接酶连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式大学生物化学第10章复制HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’目录大学生物化学第10章复制DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能大学生物化学第10章复制DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节大学生物化学第10章复制（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成

大学生物化学第10章复制E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5

3

5

3

1.DNA解链大学生物化学第10章复制DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

2.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

大学生物化学第10章复制3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶大学生物化学第10章复制（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

大学生物化学第10章复制5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目录大学生物化学第10章复制领头链的合成目录大学生物化学第10章复制随从链的合成目录大学生物化学第10章复制目录大学生物化学第10章复制阶段一阶段二大学生物化学第10章复制阶段三阶段四大学生物化学第10章复制复制过程简图目录大学生物化学第10章复制复制过程动画大学生物化学第10章复制原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止大学生物化学第10章复制5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接大学生物化学第10章复制目录大学生物化学第10章复制哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。大学生物化学第10章复制•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始大学生物化学第10章复制3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长大学生物化学第10章复制染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止大学生物化学第10章复制5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

目录大学生物化学第10章复制目录大学生物化学第10章复制切除引物的两种机制目录大学生物化学第10章复制端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…大学生物化学第10章复制端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成大学生物化学第10章复制端粒酶的催化延长作用爬行模型目录大学生物化学第10章复制DNA聚合酶复制子链进一步加工目录大学生物化学第10章复制逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四节大学生物化学第10章复制逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录(reversetranscription)RNADNA

逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶

大学生物化学第10章复制逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA大学生物化学第10章复制逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNAcDNAcomplementaryDNA大学生物化学第10章复制二、逆转录研究的意义

逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

大学生物化学第10章复制

滚环复制(rollingcirclereplication)三、滚环复制和D环复制

是某些低等生物的复制形式，如

X174和M13噬菌体等。大学生物化学第10章复制3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滚环复制5'

5

3

3

5

目录大学生物化学第10章复制dNTPDNA-polγ

D环复制(D-loopreplication)

是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。

大学生物化学第10章复制DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair第五节大学生物化学第10章复制遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。

大学生物化学第10章复制一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础

大学生物化学第10章复制二、引发突变的因素物理因素紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV大学生物化学第10章复制化学因素目录大学生物化学第10章复制三、突变的分子改变类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

大学生物化学第10章复制DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

2.颠换（一）错配大学生物化学第10章复制镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CTCGAG基因大学生物化学第10章复制（二）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。缺失或插入都可导致框移突变。大学生物化学第10章复制谷酪蛋丝5’