I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生

1/1I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生作者：

钱济先，张柏根，李桂云，张岚，邓廉夫，朱雅萍【关键词】内皮素关键词:内皮素;反义寡核苷酸;血管平滑肌细胞摘要:目的观察Ⅰ型内皮素受体反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖和内膜增生的抑制作用.方法①细胞培养:取家兔主动脉中膜消化后培养传代，经抗-actin鉴定后使用第4～6代传代细胞;②人工合成ODN:经Genbank检索筛选，合成含18bpETA-ODN片段，再对5’端硫代修饰以增加稳定性，同时行峤地高辛标记以检测反义片段的细胞膜穿透性;③MTT分光光度法检测ETA-O刑DN对VSMC增殖的抑制作用;④运用丌放射受体结合分析法了解ODN对ETA绲蛋白表达的抑制作用，以探讨其反义作用坚;⑤兔颈动脉空气干燥模型在体研究OD栲N对血管内膜增生的抑制作用:应用F-雍127凝胶载体携带ETA-ODN导入血管周围，术后不同时间观察增生内膜相醢对厚度.结果ODN于培养后12h进盗入细胞内，并逐渐增加;15molL-1ETA-ODN对VSMC增殖具有涞抑制作用，24h后即有显著作用;ET蓦A-ODN对ETA表达亦有明显的抑制霎作用，表现为CPM于24h逐渐减少;汐ETA-ODN导入后，血管增生内膜相飕对厚度减少.结论ETA-ODN以浓度和时间依赖方式抑制ETA蛋白表达以鹌及VSMC的增殖;反义寡核苷酸是通过裔反义机制实现对ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用.Antisens饥eendothelin┐1recep洛toroligonucleotide濮in┐hibitvascularsm鹗oothmusclecellprol隙iferationandintima薰lhyperplasiaAbs颖tract:AIMToevaluat栩etheinhibitiveeffe╀ctofantisenseendot佑helin-1receptoroli惴gonucleotideonVSMCぷgrowthandintimal①Cellcul-ture.Themed┮iumofrabbitaortawereharvested，digest迄edandthedispersionswerecellsofpassag池e4～6wereroutinelyusedtostudyafteride峤ntificationwith-actinantibody.②ODNa豢ntisensesequencesweredesignedandscreenedthroughGeneban冒ktheseprocedures，E悍ighteenphosphoroth猝ioateantisensecom-夙plementarytoETAcDN泅Aweresynthesized，a栖ndeventuallylabele尾dwithdigoxinbywhic戏hthesequencesstabi嚅litybeaug-mentedan蓝dmembranouspermeabilitytested.③MTTme青thodwasusedtoevaluateDNAsynthesisinO＃DNtreatedVSMC.④125敬I-ET-1radiobinding臃assaytoETAandimmun挟o-histochemistrywe遭reutilizedtoexamin展eprotEInexpression┃ofthereceptor，andt衷odiscussrolesoftheODN.⑤ODNdis-solved巯in200mLL-1F-127gel赈solutionatconcentr黪ationmolL-1wereap致pliedtosurroundthe侉exposedregionofcar汤otidarteryonthebasisofAirDrytheinti-淝malthicknessandlum板inalnarrownesscouldbe①ETA-ODNcouldbe鲥foundinculturedVSM致Cin12handgradually兆increased.②ETA-ODN筘atconcentra-tionof剧15molL-1suppresse划dVSMCproliferation绎，whichshowedasigni吁ficantactionin24h.嗒③ETAproteinexpres-sionwasreduced，ind宓icatedbythephenome镔nasthatCPMprogress窨ivelydecreasedin24ｂh.④Intimalthicknes倔sandlu-minalnarrow皇nesswerelightenedaＴfterETA-ODNETA-ODN减suppressesETAexpre嗥ssionandSMCprolife婊rationinatimeandco彩ncentrationdependentplaysanimportant蒉roleinmediatingcul杆turedVSMCprolifera呸tionexertsinhibito四ryfunctionthrougha磴ntisensemechanism.绵0引言血管移植或动脉腔内成形术后俪血管内膜均不同程度地发生增生，严重的榉可致血管狭窄或再狭窄.内膜增生的细胞简学基础是血管中膜平滑肌细胞向内膜迁移渎并增殖，因此若能控制血管SMC增殖即峁可实现抑制内膜增生.既往人们用化学药馏物，如阿斯匹林、潘生汀、肝素和类皮质檬激素等试图抑制血管内膜增生［1］，但狙效果均不理想.近年来的研究证明I型内柽皮素在诱导血管收缩和VSMC增殖方面蟠起重要作用，在动脉粥样硬化的VSMC茫中，Ⅰ型内皮素受体mRNA表达显著增凌多［2］，而且ET-1可增加VSMC蠖内3H-TdR结合率［3］，增强PDGF诱导的DNA合成［4］.现已明确爱，ET在血管内膜增生中发挥着重要的促赊分裂效应.作为基因治疗的一方面，反义拂技术已逐渐成为血管领域的重要的治疗方疙法［5］.针对ET-1及其受体ETA敬在血管SMC增殖和内膜增生中的重要作阴用，我们合成了含18bp的ETA反义送寡聚核苷酸，并经硫代膦酸修饰，在离体黾SMC培养和动物在体模型基础上探讨O粢DNS对VSMC上ETA蛋白表达、S旌MC增殖和内膜增生的影响，为防治血管幄内膜增生和血管狭窄提供实验依据.腐1材料和方法细胞培养无菌寻取家兔主动脉段，去内外膜置100mLL-1NBSDMEM培养液中，剪碎，洎吸去DMEM，加L-1胰蛋白酶震觏荡消化45min，低速离心，弃组织块噍，收集上清液加培养液移至培养瓶，置3辏7℃，50mLL-1CO2孵箱.取用刍第4～6代细胞，多余细胞分装冻存备用昃.SMC鉴定将SMC按每孔1疴104个细胞转种于置有无菌载玻片的6孔板内，37℃，50mLL-1CO2烧孵箱内培养，细胞贴壁生长至一定密度时蚤取出载玻片，免疫组化染色后观察.反义核苷酸的设计合成根据已克隆的大鼠ETA核酸序列［6］，经中科院上舒海生化所Genebank检索后，分别筛选并设计特异性高的含18bp的反义嗓片段，DNA合成仪合成30A的寡核苷酸.同法合成相应的正义片段.另外合成逸标有地高辛的反义ETA10A，以验证茯反义核酸的膜穿透性.5’端碱基硫代磷酸化修饰以增加寡核苷酸在血清中的稳定咻性.ODN的膜透性检测将地签高辛修饰标记的ETAODN与SMC共瓮培养，爬片生长，孵箱培养4，12，2拍4和48h后取出玻片，通过抗体免疫组唤化呈色反应以显示ODN的细胞膜透性.晓每种因素重复3次.ETA┐OD烧N对血管SMC增殖的作用MTT实验縻取第四代细胞接种96孔板，密度每孔貔1104细胞，孵育48h，分别加入诘，和molL-1，设立正义对照、阴┿性对照和空白对照，每组3孔，培养12锝，24，48和72h后分别加入质量分沿数为50mgL-1的MTT，孵育4h周后再加入二甲基亚砜20L，移至酶标遭仪测定光度值.细胞生长计数根据上述谌结果，用15molL-1浓度的ET模A-ODN观察对SMC生长的抑制作用.按1104密度接种24孔板，时间阖组和其他步骤同上，在倒置显微镜下计算蜍活细胞个数.ETA┐ODN对ETA蛋白表达作用放射受体结合分析法将经ETA-ODN处理过的细胞制成悬浮液，加入125I-ET-1250逯L，37℃孵育2h，离心弃上清，用疽冷DMEM快速洗3遍，进行计数.以椿加入10-7molL-1未标记的ET赴-1200L后所得的每分计数作为非粗特异性结合率，样品的cpm减去非特异邈性结合的cpm为125I-ET-1的绔特异性结合率.ETA┐ODN对哐血管内膜增生的作用的在体实验血管模帮型的建立和反义寡核苷酸的导入30菱mLL-1戊巴比妥钠静脉麻醉，家兔取ロ仰卧位消毒后，沿颈正中切开皮肤，显露祭颈动脉，轻柔剥离外膜后游离颈动脉长，捶上下无创夹阻血后，从一端注入空气，另鲠一端抽出空气，持续10min，造成血管内皮细胞脱落.在血管周围注入4℃预冷、混有ETA-ODN的200mLL拷-1F-127多聚凝胶500L，寡加核苷酸的浓度为molL-1.F-1椿27在37℃时呈固态凝胶，待其由液态奢变为固态后缝合皮肤.动物分组健让康成年家兔24只，体质量kg，雌雄不怎拘，随机分为3组，每组2只.一组为O丶DN处理组，其他两组为阴性对照组和空白对照组，术后48h，1，2和4wk塄不同时间取材.取材时注意使血管不扭曲Ё，保持合适张力.微机图像分析标本切片图像经显微摄像机摄入图像分析瓯系统后，计算血管增生内膜的厚度.其中窗内膜厚度以增生内膜厚度与中膜和内膜联黼合厚度的相对值表示，每组围绕管腔测1际0次，取平均值计算.统计学处理:组彝间采用团体t检验.2结果细胞﹃培养及鉴定VSMC经传代培养后，细胞形态稳定，抗-actin抗体免疫习组化阳性，证实培养的细胞为VSMC.ODN纯度及膜透性检测通过笈抗体免疫组化呈色反应结果:4h阴性，扔12h弱阳性，24和48h阳性.说明庠ETAODN能在12h进入细胞内，并胀在24和48h逐渐增多.ETR┐O磺DN对血管SMC增殖的作用MTT卢光度值结果如Tab1.从表中所知，1逄5molL-1的ETA-ODN24痫h与阴性对照组有显著性差异，48h与喋阴性对照组也有显著性差异;以培养后时哄间组比较，15molL-1ETA-缒ODN12与48h差异显著，12与7橘2h也有显著性差异，说明15mol绡L-1ETA-ODN对SMC增殖具有霜明显的抑制作用.正义对照组与阴性对照ぇ组相近，说明正义寡核苷酸无效.表1加缌入ETA-ODN后VSMC的光吸度值细胞生长计数结果上述结果可见郓15molL-1ETA-ODN具有倍明显抑制SMC增殖的作用，因此用上述洪浓度的ETA-ODN观察对SMC生长笾的抑制作用，表明有明显抑制VSMC生嗣长的作用.表2加入ETA-ODN后V阏SMC生长密度ODN对ETA蛋白表童达的抑制作用通过125I-ET-埠1放射受体结合分析实验，经Gamma⒁计数显示15molL-1的ETA-蝉ODN具有明显抑制ETA的表达.随培养时间的延长，ETA-ODN处理后c薪pm逐渐减少，到48h即有显著性差异甬;与对照组相比，24h即有显著性差异，说明ETA-ODN明显抑制ETA表貌达.表3加入ETA-ODN后VSMCETA┐ODN对血管内膜增生的抑击制作用经反义基因导入后，结果显示鲈ETA-ODN不仅减缓内膜增生的发展，而且对内膜增生具有明显的抑制作用.表4血管内膜相对厚度3讨论VSMC增殖和内膜增生是血管移植术、血空管成形术后狭窄或再狭窄的主要原因［7眢］.当VSMC受外界因素刺激后，细胞萏内部通过一系列信号传导系统作用，启动鳇细胞内调节细胞增殖的基因表达，最终导丞致细胞增殖.其中，血管活性因子在促进硫细胞增殖过程中起着重要作用.ET-1堀作为VSMC分裂增殖的强效生物活性物质在诱导狭窄和再狭窄发生机制中占有重要地位［8］.过去研究已经证明，VS董MC上ETA的表达与内膜增生存在正相愍关效应［9］，ET-1藉与ETA结合咀后触发的促分裂可能在内膜增生过程中发晨挥重要作用［10］.以前人们试图应用化学药物抑制VSMC增殖和内膜增生，坊但效果不理想，而且作用不特异.体外合咐成的反义寡核苷酸可特异与某些基因的D俞NA或mRNA结合，以阻止该基因的转∵录或翻译，达到削弱该基因的目的.本研打究就是应用ETA反义寡核苷酸特异抑制鳊ETA蛋白的表达，从而减弱ET-1促捷增殖效应.ET-1能显著增加细胞内3蝙H-TdR结合率，增强PDGF诱导的珧DNA合成，有人用3H-TdR结合率椹来反映细胞的增殖状态［11］.四唑蓝氵比色试验法是检测细胞生长和存活的方法漪，它与细胞计数、软琼脂克隆试验和3H-TdR掺入试验有良好的相关性，而且，灵敏度高，重复性好，操作简便、经济、汹快速、易自动化，因此本实验采用MTT挞法检测细胞增殖情况.本研究经预实验摸索并结合文献［12］报道，发现15折molL-1浓度的ETA对培养的血管犷SMC具有抑制作用，并通过膜透性检测鲠证实ETA-ODN能于培养后24h进峒入细胞内且发挥作用，说明ETA-OD疝N以浓度和时间依赖方式抑制SMC增殖，细胞生长计数也显示有良好的相关性.鲑实验还同时说明在本实验条件下ETA参与了VSMC的增殖过程，这与国外一些伸作者的实验结果相佐［13］.对细胞内刀相关基因蛋白水平的检测，能了解该基因宏在细胞功能活动中的活跃程度.由于目前痃无市售ETA抗体，本实验采用放射受体郑结合分析法间接了解ETA蛋白表达情况厕，结果发现ETA-ODN作用24h后即有明显的抑制ETA表达的作用，说明喑ETA-ODN是通过反义途径实现对E箕TA的抑制.在体空气干燥模型与球囊导管模型有同样效率［14］，均可造成血锁管内皮细胞的脱落，继而诱发内膜增生.罟但空气干燥模型操作简便快捷，损伤均匀，效果确切.F-127是一种具有特定桴物理性质的多聚凝胶，在4℃时表现为液靡态，37℃时聚合成凝胶状，利用这一特甘性，将一定浓度的寡核苷酸混合其中，转拶到动物体内后，由于温度上升，可迅速变ｉ为固态，使寡核苷酸较长期而缓慢地释放赳在血管周围，避免了短时间内大量寡核苷涣酸进入体内的副作用［15］.本结果显豹示ETA-ODN能减少增生内膜的厚度礓和管腔的狭窄，说明在体情况下ETA-ODN同样具有抑制SMC增殖的作用.应用F-127可达到局部定点高浓度缓涓释寡核苷酸的作用，有效地提高了局部效渐应，但对载体的稳定性和反义寡核苷酸的妈毒性还需作进一步研究.综上所述，E榆TA-ODN以浓度和时间依赖性方式抑告制ETA蛋白表达以及VSMC的增殖;魏反义寡核苷酸是通过反义机制实现对ET筏A蛋白和VSMC增殖的抑制作用;在抑拥制血管内膜增生和VSMC增殖方面ET凛A-ODN显示出良好的临床应用前景.事参考文献:［1］BorlandJA，ChesterAH，Crab帙beS，ParkersonJB，Ca稍travasJD，YacoubactionofangiotensinIIＶandactivi-tyofangi纹otensin-converting┎enzymeinhumanbypas①sgrafts［J］.JThorac┹CardiovascSurg，199蟾8;116:206-212.［2］ｚKikkawaK，SaitoA，Iw翊asakiH，BanY，Yasosh７imaA，Ya-mauchiKR，H霪oshinoT，Murataofce渥rebralva-sospasmbyㄧanovelendothelinre又ceptorantagonist，T鸯A-0201［J］.JCardiov⒒ascPharmacol，1999;34:666-673.［3］YanagisawaH，HammerRE，贫RichardsonJA，Willi雉amsSC，ClouthierDE，杞Yanagisawaofendoth唧elin-1/endothelin-嗪Areceptor-mediated睃signalingpathwayin杭theaorticarchpat-terninginmice［J］.JC鹰linInvest，1998;102:22-33.［4］MoritaT潼，Kourembanascellex枰pressionofvaso-con料strictorsandgrowth贩factorsisregulated溴bysmoothmusclecell蛸-derivedcarbonmono奇xide［J］.JClinInves俟t，1995;96:2676-268宝2.［5］BennettMR，Schwartztherapyforanゃgioplastyrestenosi珙s，somecriticalcons专iderations［J］.Circ疽ulation，1995;92:19呈81-1993.［6］LinHY，侍KajiEH，Winkelandfu膜nctionalexpres-sio蓉nofavascularsmooth膏muscleendothelin1r留eceptor［J］.ProcNatlAcadSci，1991;88:3觊185-3189.［7］Masoo苔dI，PorterK，Londonaяmediatorofintimalh肠yperplasiainorganc饽ultureofhumansaphe吸nousvEin［J］.BrJSur珙g，1997;84:499-503.表［8］LiGY，XinXY，Qia晁nJX，Zhuroleofen-do徕thelin-1inhumanuterinelEIomyomacells犴［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao，2000;21:36迎3-365.［9］QianJX，Q』ianZQ，HuangYT，LiGY适，WangJB，HuPZ，WangJ慝，Luextravascularmo槛delwithradioac-tiv烬erayinhibitssmooth倮musclecellprolifer婿ationandintimalhy-貂perplasiainautogen铎ousveingraft［J］.Zh齑onghuaYixueZazhi，1愍999;79:19-21.［10］幄ViswanathanM，De-Ol蹉iveiraAM，JohrenO，S散aavedraendothelinE麸Treceptorexpressio具ninratcarotidar-te肚ri