第四章 核酸的分子识别

第四章

核酸的分子识别核酸是重要的生命物质基础，对生物的生长、发育和繁殖等有重要作用。许多分子可以与核酸发生相互作用，破坏其模板作用，使核酸链断裂，进而影响基因调控和表达功能。小分子不仅可作为生物探针用于核酸的结构与功能研究，还可以核酸（DNA，RNA）为靶目标作为抗肿瘤、抗病毒、抗菌等药物的母体。因此，测定小分子化合物与核酸相互作用的亲和力，了解其相互作用的选择性有利于进一步探讨小分子的结构与核酸作用模式及其生物活性之间的关系。第一节DNA的分子识别小分子化合物与生物大分子DNA特异性的定位结合，在基因表达的调控过程及很多抗癌药物的体内作用方式的研究中非常重要。第一，DNA靶向化合物可以作为核酸探针的选择对象；第二，临床上使用的许多抗癌药物都以DNA为作用靶点，通过与癌细胞DNA发生相互作用破坏其结构，进而影响基因调控与表达功能，表现出抗癌活性；第三，一些致癌物也能与DNA形成加合物，这种DNA加合物也是可能癌变的预警标志物。因此，小分子与DNA的相互作用的研究不仅有利于探索和开发新的核酸探针，而且有助于从分子水平上了解抗癌药物的作用机理，阐明有毒物的致癌、致畸的分子生物学机理，为设计临床上更为有效的抗癌药物提供理论指导。一，DNA的结构类型

1953年，Watson和Crick在前人工作的基础上，首先提出DNA分子的右旋双螺旋结构。他们是以在生理盐溶液中抽出的DNA纤维，在92%相对湿度下进行X—射线衍射图谱测定而推设的，在这一条件下得到的DNA，称为B-DNA。经过二、三十年的研究，人们发现DNA不仅能形成右手双螺旋，也能形成左手双螺旋，甚至还能形成三股螺旋和四链体等多种形式。

G-四链体(b)i-四链体(c)左旋发卡结构(d)平行三螺旋(e)A-配对模式(f)交叉节

1，DNA的右手双螺旋结构

DNA双螺旋是由两条走向相反的互补脱氧多核苷酸链组成的右手螺旋，螺旋的外侧是磷酸和脱氧核糖间隔排列连接成的亲水主链，内侧是疏水的A-T、G-C碱基对彼此由氢键相连，双螺旋表面形成一条大沟和一条小沟。DNA的构型除主要以Watson和Crick提出的右手双螺旋构型（B-DNA）存在外，还有许多变型。也就是说DNA的结构是动态的，DNA可以随着环境的变化通过将自身扭曲、旋转、拉伸的方式把自身的构型调整为另一种完全不同的结构。

如在相对湿度为75%测出的DNA分子是A构象(A-DNA)，这一构象不仅出现于脱水DNA中，还出现在RNA分子的双螺旋区域和DNA-RNA杂交分子中，因此在DNA转录时，很可能发生B→A型的转变。将相对湿度进一步降到66%时，就会出现C型DNA(C-DNA)，这一构象仅在实验室中观察到，在生物体中还未发现。而活细胞中绝大多数DNA以B-DNA形式存在。这些研究表明DNA分子结构在不同条件下可以有所不同，但它们均为右手双螺旋，且螺旋的表面都有一条大沟和一条小沟。B-DNA036.00.3373.410C-DNA638.00.3313.19.3D-DNA

45.00.303

双螺旋碱基倾角/(°)碱基夹角(°)碱基间距/nm螺距/nm每轮碱基数A-DAN2032.70.2562.811DNA分子在水、乙醇中的B、A型双螺旋结构

DNA双螺旋的结构差异来源于核酸骨架构象固有的可伸缩性，如五元糖环的可折叠性以及糖苷键的旋转。其中糖环的构型、碱基相对糖环的顺式或反式构型是核酸构型的重要结构特征。而除了Watson-Crick碱基配对方式(G-C之间形成3个氢键，A-T之间形成2个氢键)外，还发现有另外27种在任何2个碱基之间形成至少2个氢键的截然不同的可能方式。其中包括9种形式的嘌呤-嘧啶的碱基配对、7种嘌呤-嘌呤的碱基对、4种异型嘌呤-嘌呤的碱基对、7种嘧啶-嘧啶的碱基对。另一种著名的配对形式叫做Hoogsteen碱基配对，在腺嘌呤和胸腺嘧啶之间形成氢键。2，DNA的左手双螺旋结构1979年美国麻省理工学院的AlexanderRich和他的研究小组在研究人工合成的CGCGCG单晶时，发现该单晶呈向左的螺旋，且它的两条主链呈Z字形环绕分子，Rich就将这种独特的结构称为Z-DNA。后来发现在细胞DNA分子中也存在有Z-DNA结构。左手DNA双螺旋结构（Z-DNA）的形成是DNA单链上出现嘌呤和嘧啶交替排列所造成的，如CGCGCG或CACACA。在细胞内尽管DNA上具有这样的区段，但在正常情况下DNA仍形成稳定的B-DNA结构。只有当胞嘧啶的第5位碳原子甲基化时，在甲基的周围形成局部疏水区，这一区域扩展到B-DNA大沟中，使B-DNA不稳定而转变成Z-DNA。这种C5甲基化现象在真核生物中是常见的，因此B构象的DNA中存在Z-DNA构象是可能的。现已证明Z-DNA参与基因调节-控制基因的启闭。因为Z-DNA的形成，使局部DNA双链处于不稳定状态，这就有利于DNA双链解开，而DNA解链是DNA复制和转录的必要环节。Rich小组利用Z-DNA抗体，证实在DNA调节基因转录的区域中存在Z-DNA(一个DNA短的片段)，并发现这种短的片段既能增强基因的活性，亦能抑制附近基因的活化，这主要取决于环境的不同。在细胞分裂过程中，Z-DNA可能还参与基因的重组。另外，由于Z-DNA分子中大沟消失，小沟深而狭，含有更多的遗传信息，也可能通过蛋白的不同识别方式，来调节细胞的多种生命活动。3、DNA的三螺旋结构1957年，A.Rich等用两条多聚尿嘧啶核苷酸链和一条多聚腺嘌呤核苷酸链合成出一种三链结构的物质，并提出了DNA三螺旋结构的概念。近年来对于DNA三螺旋结构和功能的研究已经取得了很大的进展。DNA的三螺旋结构与双螺旋结构相似，都是通过DNA单链之间形成氢键实现的。

H-DNA是一个分子内的三螺旋结构，链上含有较长的多聚嘌呤-多聚嘧啶的DNA序列，在低pH值条件下会形成H-DNA。在这个结构中，富含嘧啶的链与其互补的链部分解离，然后平行地结合在Watson-Crick双链的大沟中。一般认为这种结构在基因的表达中对转录的控制有一定的作用。另外人工合成的多聚核苷酸和寡核苷酸也形成这种类似结构。体外实验表明,三螺旋DNA的形成阻碍了由DNA聚合酶催化的DNA的合成,抑制了基因的表达。

DNA三螺旋结构的特点

1）组成三螺旋的DNA单链，一般都是由单一的嘌呤碱基（A和G）或单一的嘧啶碱基（C和T）所组成。（2）DNA三螺旋的基本结构有两种，一种是由两条多聚嘧啶碱基核苷酸链和一条多聚嘌呤碱基核苷酸链组成，即嘧啶-嘌呤-嘧啶。三条链中碱基形成氢键的情况是：T-A-T,C-G-C。第二种是由两条多聚嘌呤碱基核苷酸链和一条多聚嘧啶碱基核苷酸链组成，简单表示为嘌呤-嘌呤-嘧啶。三条链中碱基形成氢键的情况是：A-A-T，G-G-C。上述两种结构中，中间的碱基必须是嘌呤碱基。（3）每一条单链至少由8个核苷酸组成。

DNA三螺旋结构的三种示意图

4、G-四链体

G-DNA是四链的核酸，在金属阳离子的参与下形成的一个独特结构。最早有关四链结构的数据是在1992年通过对富含鸟嘌呤的DNA序列进行x射线晶体衍射和NMR研究得到的。人们发现在染色体端粒末端以及一些重要的肿瘤基因转录调节区，具有这种特殊的结构序列。因为肿瘤基因表达的端粒维持机制和转录调节已成为肿瘤药物设计的重要靶点，所以G-四链体结构有可能成为抗肿瘤药物的新靶点。

G-四链体DNA由堆积的G-四分体组成，而每个四分体则由4个鸟嘌呤以环状氢键作用平面互联构成。一价阳离子如K+或Na+能稳定G-四链体，推测其可能是通过与四分体中8个羰基氧原子的相互作用所致。现已发现，体外存在着几种G-四链体结构，根据它们的分子特性及螺旋取向，G-四链体可分为如下几类：①含有鸟嘌呤重复序列的4个TTAGGG单链所形成的分子间四链体[即平行型四链体]；②含有两个或多个鸟嘌呤重复序列[(TTAGGG)n，n>2]的DNA可形成G-G发夹型(hairpin)，接着双分子化构成几种稳定的双分子四链体结构；③具有4个或更长的鸟嘌呤重复序列[(TTAGGG)n，n≥2]可以自身折叠形成分子内的四链体结构[即自身折叠型(foldover)四链体。i-motif（C-四链体）四链核酸结构除了G-四链体,还包括C-四链体(i-motif).胞嘧啶C在低pH时发生质子化生成胞嘧啶C+,C+一定程度上与G相似,与C形成三组氢键的C•C+配对.体外研究发现,富含C的寡核苷酸片段容易发生部分质子化,C与C+发生配对形成平行的双链结构,两条双链之间通过C•C+反向互相识别,从而形成了一种新的四链结构称为i-motif结构。i-motif结构可由富含C的单分子DNA序列反复折叠、折叠的双分子序列或四个单分子序列的相互作用形成。一些蛋白能够选择性地和这种四链结构结合，因此C-四链体的研究具有重要的生物学意义。G-四链体可能的生物学作用

尽管含有G重复序列的DNA在体外Na+或K+的生理浓度下，可以很容易形成G-四链体结构，但在体内G-四链体的形成可能要复杂得多。首先是含重复G碱基的基因组在细胞周期中通过碱基配对形成稳定的双链螺旋结构；其次，在体内DNA通常与特异或非特一性蛋白质结合在一起；再者，体外分子间G-四链体的形成需要较高的DNA浓度，这在体内不可能实现，况且在体内G-四链体的形成可能不需要如此高的DNA浓度。G-四链体可能为一正常结构，其在细胞内可自行聚集和解聚。由于在复制、重组、转录和端粒DNA延长过程中，双链DNA在细胞内会短暂地分离为单链，因此为富含G的DNA链形成G-四链体提供了机会。端粒的保护和延长

端粒是真核细胞中线性染色体的特殊末端。由呈串联排列的双链重复亚单位DNA片断和一段单链富含G重复亚单位(TTAGGG)的突出及端粒结合蛋白所构成。为避免端粒的降解、端端融合、重排和丢失而引起基因不稳定和细胞衰老，维持单链突出的完整性是细胞存活所必须的，而G-四链体的形成提供了保护3′-末端突出的可能的分子机制。其可能的机制是，端粒DNA短暂地形成自身折叠型G-四链体结构，从而提供牵引力以置换及帮助DNA底物和RNA模板所形成的碱基对向后移动一个重复序列；其后，在端粒DNA和RNA重新配对进行下一个延长循环前，G-四链体又解聚为一单链。

端粒DNA含有许多短的重复序列，这种富含G的核酸链有一段突出的单链，G-四链在这里形成。正常的体细胞在连续不断的细胞分裂循环中会逐渐丢失端粒的重复序列，最终导致细胞死亡。这个过程被端粒酶补偿。端粒酶是一种逆转录酶，它用于延长端粒DNA的3’-末端。在正常的体细胞中端粒酶不被激活，相反80％-90％的肿瘤细胞都表现出端粒酶的活性。端粒酶维持端粒的长度，从而也维持了细胞分裂的能力。端粒酶在肿瘤细胞中高度表达，被作为很有前景的癌症治疗靶标。转录调节

某些重要基因的启动区，例如人或鸡β-珠蛋白基因、兔前胰岛素原II基因、腺病毒血清型2、视网膜神经蚀质瘤敏感性基因和c-Myc基因中，皆发现有富含G的重复序列，因此它们都具有形成G-四链体结构的可能性；通过查找基因数据库，发现其他一些肿瘤基因启动区也具有富含G的重复序列。这些发现促使研究人员推测G-四链体在基因转录调节过程中起一定作用。另外，G-四链体能阻断RNA聚合酶。因此当基因密码区的富含G重复序列形成G-四链体，而又不易解聚时，可能会起到抑制RNA聚合酶的作用，从而引起早期转录的停止。5，DNA的超螺旋结构

超螺旋（Supercoil），简单地说就是螺旋的螺旋。超螺旋的形成不是一个随机过程，而是当DNA存在一定张力时才会形成。由于DNA双螺旋的盘绕过度或不足，使DNA分子处于一种张力状态，在封闭环状DNA分子中的这种张力不能释放出来，就会形成超螺旋。超螺旋的形式中心轴的盘绕同双螺旋两条链盘绕的方向相反，称为负超螺旋。负超螺旋能让DNA分子通过调整双螺旋本身的结构来减少这种张力。一般是减少每个碱基对的旋转，即放松两股链彼此的盘绕，所以把具有负超螺旋的DNA称为盘绕不足DNA。如果负超螺旋产生的张力较大，可能破坏局部的碱基配对，而使双螺旋局部解链。正超螺旋会使螺旋更加紧密，所以把正超螺旋称为过分盘绕DNA。几乎所有天然DNA都是负超螺旋类型。(a)松弛环状DNA

(b)负超螺旋的DNA

(c)负超螺旋引起链的分离超螺旋的形式中心轴的盘绕同双螺旋两条链盘绕的方向相反，称为负超螺旋。负超螺旋能让DNA分子通过调整双螺旋本身的结构来减少这种张力。一般是减少每个碱基对的旋转，即放松两股链彼此的盘绕，所以把具有负超螺旋的DNA称为盘绕不足DNA。如果负超螺旋产生的张力较大，可能破坏局部的碱基配对，而使双螺旋局部解链。正超螺旋会使螺旋更加紧密，所以把正超螺旋称为过分盘绕DNA。几乎所有天然DNA都是负超螺旋类型。DNA超螺旋是一种几乎全部DNA具有的属性。质粒，细菌染色体，线粒体和叶绿体以及许多病毒基因组均以闭合环状DNA出现，Lk是这种分子的固有属性。DNA超螺旋对DNA协作过程有直接或间接的影响,大多涉及到特定蛋白质和DNA相互作用。与自由DNA相比，负超螺旋DNA(自然界更常见)是一个高能量构象，这种额外的能量可通过蛋白质的结合而释放。6、DNA的弯曲结构DNA弯曲一直是一重要而又令人难以理解的问题，这一问题有明显的生物学意义.诸如核小体中DNA卷曲、限制性内切酶对特殊位点的识别、代谢激活蛋白(CAP)和TATA结合蛋白(TBP)等与DNA的结合常常涉及DNA的明显弯曲。核小体核小体以组蛋白H2A、H2B、H3及H4各2个分子组成的八聚体为核心，双股螺旋DNA分子绕在每个八聚体外面这一段DNA分子，叫核小体。核小体进一步演变为所谓染色质的二级结构一螺旋管。螺旋管还需要进一步的折叠和盘曲。再经过折叠，成为染色单体。7，核酸凸起结构(Bulge)

在双链DNA或RNA中存在未配对的核苷酸时，会形成凸起(bulgedloop)，凸起处可以有一个或多个碱基，根据凸起所在位置，可以分为如图所示的几种类型。DNA和RNA都可以形成三向或四向联结体(threewayorfour-wayjunction)。在DNA中发现两种类型的四向连接，即十字形(cruciform)和Ho11iday联结体。十字形是在超螺旋DNA中形成的一种分子内结构．而Holliday结构连接两个分离的DNA分子，这种结构出现在基因重组过程中。十字形连接在反向重复序列或回文序列中形成，它包含三个部分，即环、茎和四向连接。通常茎为B-构型，且碱基完全配对。环是单链结构，位于每个包含有2个或多个未配对碱基的茎的末端。Holliday联结体出现于两个同源的DNA序列。序列的等同性使一条链既可以与原来的互补链的碱基配对，也可以与第二条双链的互补区域的碱基配对。形成Ho11iday联结体要求这两条螺旋链处于邻近位置，以便于产生沟-骨架的相互作用(DNA的自适应)。Holliday联结体一旦形成，将出现两种过程：一是支链的迁移，此过程中同源双链之间的碱基对发生交换，Ho11iday联结体沿着DNA螺旋移动。二是Holliday的溶解消逝，此过程中四条链中的两条链被酶切断，产生两个对称的双螺旋。四向联结体结构在真核和原核生物中都参与重要的生物学过程。十字形结构短暂的形成是DNA复制起始的先决条件。Ho11iday联结体在染色体重组中出现，参与基因表达和核酸损伤的修复。Ho11iday联结体可认为是两个双螺旋共线缔合形成的一个类似于X形的结构。这种结构的主要特征，一是连接臀通过螺旋-螺旋堆积作用缔合成对，因相互堆积的螺旋对的不同而可能出现两种构型；二是在这个结构中有两个对称铀，从而产生了两组不同链-有两条链连续地通过链的交叉点，而另两条链则在两个双螺旋之间交换。

二、双链DNA的分子识别化合物与DNA的结合方式根据DNA分子结构特点，作用于DNA的小分子药物一般又分为烷化剂（包括交联剂）、嵌入剂、DNA沟区结合剂以及DNA断裂剂。许多新型的DNA结合剂常常具有双重特点，如将具有选择性的沟区结合剂或嵌入剂上连接烷化剂、催化水解、氧化的活性基团形成专一性的新型烷化剂、断裂剂或断裂剂。1，靶向DNA小沟区的非共价作用DNA双螺旋的表面有两个凹下去的槽，一个大槽和一个小槽，分别称为大沟和小沟。大沟区中有大量的氢键受体和供体，它们的亲和力决定了该区有较强的序列识别能力，主要结合一些特异性蛋白。分子量小于1000的小分子，包括一些抗生素，主要作用于小沟区。这是由于DNA小沟区常常处于一种空穴状态，易受外界物质的攻击。小分子药物与DNA作用主要是与胸腺嘧啶基C-2位的羰基氧或腺嘌呤基N-3位的氮原子形成氢键，虽然同样的基团在GC碱基对上也存在，但鸟嘌呤上的氨基对氢键的形成有空间位阻作用。沟区结合剂的结构特征典型的小沟区结合的药物分子具有以下特征：1，由几种简单的芳香杂环结构如呋喃、吡咯、咪唑或苯环构成平面共轭体系；2，整个分子常常呈“月牙”形状；3，分子两端一般含有碱性的氨基、咪基或胍基。这些芳环由扭转自由的键来连接，由此产生合适的扭转力来匹配小沟区内的螺旋曲线，取代沟区中的水分子并与DNA双螺旋链个沟区的碱基对边缘通过氢键、范德华力、静电相互作用在小沟中的AT富集区与DNA形成一种三明治的结构，具有一定的特异性。（1）偏端霉素(distamycin)

偏端霉素Ａ对DNA的AT富集区有高选择性，尤其与5

-AAATT-3

序列的结合性非常好。具有很强的抗病毒和抗肿瘤活性由于它在体内有很强的不良反应,没有用于临床。此类抗肿瘤抗生素能够对称地位于Ｂ型DNA小沟的中间，分子中的每一个酰胺键均与相邻的碱基腺嘌呤的Ｎ(3)和另一条链上的胞嘧啶的Ｏ(2)形成桥型的氢键。

将咪唑环引入偏端霉素类似物中[咪唑环的Ｎ可以与鸟嘌呤Ｃ(2)的氨基形成氢键，以期获得对GC碱基对具有识别功能的小分子，提高寡聚酰胺的识别特异性；偏端霉素的核心结构是寡聚的吡咯酰胺，分子中不含手性中心，容易合成。几个偏端霉素类似物，并发现它们对肝癌细胞、胃癌细胞有显著的抑制作用；用荧光与圆二色散谱研究了它们与小牛胸腺DNA、鱼精DNA的相互作用。经过筛选寻求高活性、高选择性、低细胞毒性的基因选择药物。偏端霉素与AAATT的2:1复合物

偏端霉素与AATT的1:1复合物(2)纺锤霉素(netropsin)

Netropsin是一种抗病毒物质，Dickerson及合作者已经得到了nertopsin结合到DNA双螺旋结构d(CGCGAATTCGCG)2的结晶，通过X射线衍射得到了在小沟区形成的复合物的晶体结构，netropsin结合到DNA双螺旋的AATT中心，并取代了该区域中的寡核苷酸水合骨架部分。它的特异性与指向中心的酰胺NH基和DNA小沟处的腺嘌呤碱基的N-3及胸腺嘧啶碱基的O-2形成氢键有关。它通过范德华力与DNA沟区边缘的原子接触而保持在沟区中心。另外，由于该药物为二价阳离子物质，故其与DNA之间的静电作用也会增加AT结合的特异性。(3)SN6999

药物SN6999具有高AT碱基对选择性，结合在DNA小沟区。它本身具有抗疟药氯喹及其他类似的化合物所具有的能够与DNA嵌插的喹啉环。通过2D-NMR的方法研究了SN6999与寡聚序列d(GCATTAATGC)所形成的1：1的络合物在溶液中的细微结构。结果表明化合物的确结合在小沟区，而且确证了它不像喹啉那样与DNA发生嵌插结合，药物的弯月形曲线正好适合双螺旋的小沟区，像其它沟区结合分子一样与AT碱基对形成氢键。(4)Hoechst33258Hoechst33258是一种苯并咪唑类分子，被广泛用来作DNA荧光标记。它具有一定的抗肿瘤活性，对4～5个碱基的Ａ/Ｔ序列有很强的亲和性,结合在AATC序列的CG部分的末端。hoehst33258分子弯曲形状在结构中与DNA小沟区的曲线很符合，药物分子与DNA小沟区的边缘形成了多种多样有利的接触，这些反应明显地造成了使络合物稳定的自由能。以Hoechst33258为母体，发展了一批苯并咪唑类分子(例如31，32，33)。通过改变取代基或采用二聚、三聚的形式，可以有效提高分子与DNA的结合性，在这其中氢键起着主要的作用。例如，头对头的二聚苯并咪唑类分子33既可以与单链的tRNA结合，又可以与双链DNA的Ａ/Ｔ富集区结合；咪唑环的引入，则可以提高与非Ａ/Ｔ富集区的结合性。（5)BerenilBerenil是一种在DNA小沟区结合的抗锥虫病药。berenil优先结合在至少4个碱基对长度的AT富集区。竞争性反应表明，berenil是比netropsin和distamlycin更弱的结合配基。对berenil与d(CGCGAATTCGCG)2复合物的x射线衍射研究表明，该物质结合在寡核苷酸的5‘-ATT—3’区域。药物的一个脒基与互补于AAT的腺嘌呤碱基的N—3位形成氢键，另一脒基不与DNA直接接触，而是与结合在腺嘌呤碱基和脱氧核糖环氧原子上的一个水分子形成氢键桥。1,5-二(4-脒苯酚基)戊烷(3)可以与双链DNA结合(主要识别A/T碱基对，识别序列的长度约4个碱基对)，并具有治疗肺炎的临床效力。对此结构上进行修饰，中间用呋喃将两个苯咪连接起来衍生出一系列化合物。用一个苯并咪唑取代了苯基，结果发现它能以反向平行的二聚体通过嵌入方式结合在Ｇ/Ｃ富集区。（6）DAPIDAPI(4

,6-二氨基-2-苯基吲哚)，也被广泛应用于染色体DNA的荧光标记。它是一个典型的DNA小沟Ａ/Ｔ富集区结合分子，但它也能嵌入结合在Ｇ/Ｃ富集区(Ｇ/Ｃ区结合力不如Ａ/Ｔ区)。DAPI通过脒基上的氮原子与环外鸟嘌呤的氨基形成氢键，来有效识别Ａ/Ｔ富集区中5

-GGCGAATTCGCG-3

序列和5

-GGCCAATTGGG-3

序列。（7）寡聚酰胺

受偏端霉素结构的启发，Dervan设计了以寡聚酰胺为模板的DNA识别分子。为了让寡聚酰胺分子能与GC碱基对有效结合，合成了ImPyPyDp分子(Im=N-甲基咪唑；Py=N-甲基吡咯；Dp=N，N-二甲基丙胺)。寡聚酰胺识别DNA的基本规则

本来预期识别的序列为G(A/T)3，但它却以2∶1的比例、反向平行地与ＤＮＡ小沟区的(A/T)G(A/T)C(A/T)序列结合。反向平行成对的Py/Im特异识别C-G碱基对，而Im/Py识别G-C碱基对；反向平行成对的Hp/Py(Hp=N-甲基-3-羟基吡咯)特异识别T-A碱基对，Py/Hp识别A-T碱基对。Ｘ晶体衍射实验表明：在Im/Py与G-C碱基对之间共有三个氢键，其中咪唑环的N(3)与鸟嘌呤环外的氨基之间有一个氢键；而在Hp/Py与T-A碱基对之间共有三个氢键，其中Hp与胸腺嘧啶的O(2)之间有两个氢键。在2∶1的寡聚酰胺-DNA复合物模型的基础上，Dervan等又设计了发夹状(hairpin)的寡聚酰胺(通过氨基酸将两条反向平行寡聚酰胺链的C端与N端连结起来)。DNA酶Ⅰ印迹实验结果表明:这种“头对尾”的头针状寡聚酰胺的序列选择性和亲合性优于两条独立的反向平行酰胺链。几种连接子的对比实验显示，由

-氨基丁酸充当连接子形成的头针状寡聚酰胺具有最好的亲合性。进一步研究发现，

-氨基丁酸(

)以及β-丙氨酸(β)不仅充当连接的角色，也是具有一定序列选择性的重要基团(

-氨基丁酸和β-丙氨酸与A-T/T-A的结合性相对G-C/C-G要强200～400倍)。相对于独立的两条寡聚酰胺链，头针状寡聚酰胺与DNA的亲合性提高了约400倍，而将头针状寡聚酰胺的两端再用一个

-氨基丁酸关环，形成环状的寡聚酰胺，则能进一步提高亲合性(10～40倍)和序列选择性。从生物活性实验来看，寡聚酰胺不仅进入细胞内，而且能够有效地调控基因表达。研究发现，八环的寡聚酰胺分子能识别转录子TFIIIA的特定结合部位，从而抑制非洲蟾蜍(Xenopus)肾细胞的5SRNA基因表达。生物活性实验表明：寡聚酰胺能抑制HIV1的转录及复制。寡聚酰胺还能参与激活(正向调控)基因表达的活动。将设计的寡聚酰胺代替原来的DNA结合部位，用一段非蛋白的连接子替换通常的二肽连接子，再用已知具有激活作用的多肽ＡＨ作为激活部位，设计出一个全新的转录激活因子47。这个全新分子在体外实验中被证实具有转录激活作用。

激活基因表达的寡聚酰胺从寡聚酰胺分子的研究中不难看出它是一个新型的调控基因表达的DNA识别分子，它不仅具有高的选择性与结合性，还有良好的细胞穿透性，而且能有效地抑制或激活基因转录。

2，与DNA双螺旋的嵌插结合作用有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，称嵌入剂，它们多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为6.8A

，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍。嵌插结合的作用力来自芳环的离域π体系与碱基的π体系间的π-π相互作用及疏水相互作用。通常稠合芳环体系都倾向于结合在GC富集区，而对于一些含有庞大取代基的分子，如吡啶环取代的卟啉分子在与DNA作用时，吡啶环取代基会尽量旋转，以保持与母环的共平面，从而形成良好的堆积形状与DNA碱基嵌合，当DNA靶向分子嵌入DNA碱基对之间后，有的可以直接抑制DNA复制与转录的功能；有的则在经过进一步活化后，使DNA断裂受损而影响其功能。（1）经典的嵌插结合在经典的嵌插模型中，由于嵌插部位的形成引起了碱基对的分开，螺旋伸长0.34nm，这正是典型的芳香系统的厚度。由于嵌插，螺旋解链，造成螺旋扭转角的减小，不同的嵌插剂结构及不同的DNA序列造成的解链程度是不同的，乙锭及丙基哌啶与DNA嵌插时解链角是26

，丫啶及丫啶橙的解链的解链角是17

，而柔红霉素及阿霉素则是每个结合分子令DNA解链11

，一些药物分子正是通过嵌入DNA令DNA构象发生改变，使其不能或不易复制，而显现出抗肿瘤、抗病毒的活性的。嵌插结合方式的特征嵌插造成了DNA双螺旋的解链和伸长，这是嵌插结合方式的一个重要特征。伴随着嵌插，DNA的螺旋骨架所受到的干扰，通过CD光谱来评价嵌插络合物键的刚性及方向性的改变。嵌插入DNA的小分子与碱基对形成有序的堆积，在双螺旋中以

-

共扼，偶极-偶极相互反应从电性上达到稳定。在紫外、可见光的测定中发现，嵌插结合常常引起减色效应，使最大吸收波长向长波长方向移动，出现等吸光点。在荧光测定中可观察到由于嵌插作用所产生的荧光淬灭现象。根据所得到的光谱滴定数据，可以测定络合物表现稳定常数，结合位点数等等。嵌插剂分子芳香环上电性环境的改变也造成了嵌插部位芳环原子的1HNMR谱的化学位移向高场方向移动，同时由于弛豫时间的改变，谱峰明显拓宽。这类嵌入剂包括吖啶黄、吖啶橙等吖啶类化合物，以及乙啶类化合物。这些化合物插入DNA双螺旋的邻近碱基对之间使DNA链拉长。

阿霉素和柔红霉素临床上广泛应用的抗癌药阿霉素及与之结构很近似的柔红霉素，二者均为典型的DNA嵌插剂。Wang，Rich及合作者已得到了柔红霉素和寡核苷酸d(CGTACG)第一个单嵌体结晶的x射线衍射的结果。表明柔红霉素能够嵌插在DNA小沟区，它与GC部位结合，随之氨基糖伸向内部且基本上填充了小沟区。柔红霉素特别容易与B-DNA结合，表现出对DNA不同构象的识别特异性。柔红霉素和阿霉素的结构

金属配合物嵌入剂金属配合物与聚核苷酸的相互作用并不只局限在金属中心与聚合物直接配位，还存在着大量选择性很高、较弱的非共价作用。一般出现在已经配位饱和的金属配合物与核酸之间，参与配位的配体的嵌插作用是非共价性缔合的典型例子。20世纪70年代，Lippard等人首先对Pt2+配合物的嵌插作用进行了深入研究，发现含有三联吡啶配体的平面四方形铂(II)配合物能嵌入DNA的双螺旋中。

金属配合物嵌插作用的特点

①配体的结构与DNA作用的金属配合物中，许多配体一般本身就具有平面的芳香性的杂环结构。当金属离子，如Zn2+、Co3+、Ni2+、Cu2+、Ru2+、Pt2+、Rh3+

等与配体形成配合物后，配合物中的一个配体部分地插入了螺旋之中，引起其他配体部分发挥出和一定要求相符合的匹配作用。常见的配体有1,10-菲咯啉类化合物、菲醌二亚胺、屈醌二亚胺、2,2-联吡啶等。

一些具有平面芳香性杂环的配体的结构

②具有插入作用金属配合物可以为平面四方形结构，也可以为八面体型的结构，如三(菲咯啉)配合物。金属配合物包括平面四方型的(三联吡啶)Pt(II)配合物及八面体型的三(菲咯啉)金属配合物总是选择从螺旋的大沟插入DNA的双螺旋中。③有芳香性配体的过渡金属配合物通常还发生小沟结合作用，或大沟插入与小沟结合相混合。如四面体型的[Cu(Phen)2]+

，因为其四面体配位结构不利于嵌插作用中要求的菲咯琳环与碱基间的重叠堆积，主要表现出小沟结合作用。而金属卟啉配合物或通常带有非平面取代基的金属配合物，尽管分子较大，却表现出同时与双螺旋DNA发生嵌插作用及富AT序列上的小沟结合作用。

④手性配合物与DNA作用表现出构象选样性，如[Ru(phen)3]2+、[Co(phen)2Cl2]+

等表现出对B-DNA的对映体选择性。

由于配合物的阳离子容易接近DNA磷酸，邻菲罗啉氮杂环易和碱基堆集，所以手性相同者位阻小，反之位阻大。因此，利用过渡金属配合物的荧光光谱特征，作为DNA的光谱探针，可判断与金属配合物结合的部位是Z-DNA还是B-DNA。

具有插入作用的金属配合物

具有插入作用的金属配合物，尤其是过渡金属离子配合物较多，这类化合物具有以下用途：①作为核酸的荧光光谱探针，研究核酸的结构和功能；②可望设计并合成出性能优良的抗肿瘤药物或抗病毒剂；③可望设计成人工核酸酶，从而实现对DNA链上某些位点的特异性剪切。金属卟啉配合物

金属卟啉是一类广泛存在于自然界中的生物活性物质，阳离子的四(4-N-甲基吡啶基)卟啉(T4MPyP)及其金属配合物比阴离子型卟啉对癌细胞的光动力效应强，因而被当作DNA靶向模型化合物而广泛研究，而且具有抗逆转录病毒作用。一般认为，没有轴向配体的金属卟啉阳离子优先嵌入结合在5′-CG-3′序列的碱基对平面之间，同时引起DNA构象相应的变化。具有轴向配体的金属卟啉阳离子因其产生较大的空间阻碍，则以空间匹配及静电作用优先对DNA螺旋小沟中连续的AT碱基对识别。金属铑配合物

金属铑与邻二氮杂菲(phen)络合配合物多是依靠氢键以及范德华力作用于DNA的大沟区。相对左手型的Δ-异构体，右手型的Δ-异构体更易嵌入右手螺旋的DNA。由于此类络合物空间结构上比较紧凑，形成了相对屏蔽的表面，因此邻二氮杂菲配体无法深度嵌入DNA中，此类化合物与DNA的亲合性不高。这促使研究者考虑外形更长、表面积更大的配体，如DPB，dppz，phehat(1,10-phenanthrolino-1,4,5,8,9,12-hexaazatriphenylene)等，如Δ-[Rh-(DPB)2phi]3+(phi=phenanthrene

quinoe

diimine)，有效的提高了与DNA的结合力。

在光的诱导下，Δ-[Rh-(DPB)2phi]3+可以选择性地切割5

-CTCTAGAG-3

中的胞嘧啶位点。但是它的光学异构体

-[Rh(DPB)2phi]3+即使在1000倍的浓度下也不能切割该位点。基于这种选择性，Δ-[Rh(DPB)2phi]3+被成功用于抑制XbaI限制性内切酶的活性。为了增强与DNA的结合和识别能力，在邻二氮杂菲(phen)上引入胍基，图9-28列出的化合物是带有胍基衍生物的三种几何异构体，每一种异构体有两个光学异构体，这些不同的异构体显示出对DNA不同的识别性。其中，

-1-Rh(MGP)2phi5+(MGP=4-guanidylmethyl-1,10phenanthroline)的两条胍基臂沿轴向伸展至phi平面上方与phi配基同向，能有效识别5

-CATATG-3

序列并与之紧密结合；而

-2-Rh(MGP)2phi3+的胍基则远离phi配基，仅显示出与母体Rh(phen)2phi3+类似的选择性；

-2-Rh(MGP)2phi5+的选择性则介于两者之间。

金属锌大环四氨络合物

一些大环四胺与锌的络合物，及带芳环的衍生物在水溶液中能够选择性结合脱氧胸腺核苷(dT)和尿核苷(U)。二价Cu离子的配合物

二价Cu离子与N,N

-二甲基-1,10-邻二氮杂菲-2,9-二甲胺的络合物，该络合物通过共价键和嵌入的方式与DNA结合，其中DNA碱基中的Ｎ或Ｏ可以在轴向上与二价铜离子发生相互作用。推测这类二价Cu与N,N

-二甲基-1,10-邻二氮杂菲-2,9-二甲胺的络合物也是结合在DNA小沟区。

(2)带有多个大取代基的嵌插剂

如果嵌插剂带的取代基太大，或有极性，或带电荷，则对嵌插结合及分解的动力学都会有影响。抗癌药放线菌素D(actinomycin，ActD)与诺加霉素(nogalamycin)就属于这一类。放线菌素DActD主环部分苯骈恶嗪酮环在DNAGC序列碱基对之间嵌入。药物的GC序列结合特异性与之能与鸟嘌呤的氨基形成氢键有关。双链d(CGTCAACG)2能以一种强的协同方式与两个ActD分子结合，结合后的异常光谱和热力学测量提示药物与这种双链的作用还不属于在DNA小沟区的经典嵌入方式。序列CGTC是一种ActD的强结合位点。由于ActD是一种DNA嵌插药物，它与DNA结合后可能引起DNA扭曲。由于药物诱导的DNA结构变化所造成的DNaseI切割速率的增强。诺加霉素

Nogalamlycin是一种与DNA结合的蒽环抗生素，连在药物糖苷配基上的是一种诺加糖和一个大的双环氨基糖。药物交连于双链磷酸二酯键骨架之间。糖苷配基的三个芳环嵌入DNA中，诺加糖位于DNA的小沟区，而双环氨基糖位于DNA的大沟区。(3)双嵌插

双嵌插剂是两个嵌插环被不同长度的链共价连接起来。这些化合物相对于一元嵌插剂来说，作为药物的生物活性往往由于与DNA的强结合而加强，分解速率也低。合成的双嵌插剂的代表是一些丫啶类的双嵌插剂。连接链的长度对嵌插的影响天然的双嵌插剂是以三骨菌素A(triostinA)和棘霉素(echinomycin)为代表。优先DNA的CpG位点，覆盖6个碱基对，以NNCGNN这种类型的序列比较有利，双嵌插剂上所有的喹喔啉环都是双嵌插到GC序列中，形成“三明治”结构。3,烷化剂早期使用的绝大多数抗癌药仅具有简单的使DNA烷基化的功能，如氮芥。它们对细胞的作用基本上没有选择性，所以临床使用有严重的毒副作用。以后发展的是一些天然抗癌抗生素，它们的作用特点是首先与DNA形成非共价复合物，然后再与之共价结合。这些杂环化合物最初的作用是干扰DNA、RNA的合成来达到杀菌的目的，但很多这类化合物却也表现了明显的抗癌活性，而且具有选择性毒性。（1）丝裂霉素C

丝裂霉素C是一种抗癌抗生素。经酶的还原活化会引起结构中某些碳位甲醇组成的脱去，继而进行DNA的烷基化。(2)氨茴霉素等氨茴霉素、茅屋霉素、西伯利亚霉素以及新乳霉素A和B都属于这个家族的抗癌抗生素，它们与DNA作用有两个过程，首先迅速地非共价地结合在DNA的小沟区，再通过失水或醇与鸟嘌呤碱基上N-2形成共价键，这个结构无论从立体因素还是静电因素分析都是稳定的，且表现出对DNA的5’-PuGPu序列明显的结合特异性。氨茴霉素与寡核苷酸d(ATGCAT)2结合的产物已经通过NMR技术进行过表征分析，在分子力学方面也进行过一些研究，结果表明鸟嘌呤的N-2共价结合到C-11上，在复合物所呈现的构象中抗生素恰好位于DNA小沟区中。氨茴霉素与DNA鸟嘌呤上氨基N-2结合

（3）螺旋丙烷类抗生素

CC-1065是此类中较新的抗生素，有较强的细胞毒作用，它首先序列特异性地作用在DNA小沟区。由于它攻击腺嘌呤N-3位，脱嘌呤作用的发生会产生一个活性部位，序列分析表明CC-1065对DNA的AT富集区有选择性。(4)铂配合物

铂族金属配合物的生物活性发现于1965年。第一代铂族抗癌药-顺铂（Cisplatin）于1978年在美国上市，而第二代铂族抗癌药-卡铂(Carboplatin)于1984年在英国上市。现在顺铂、卡铂已成为治疗癌症最有效的药物之一，在世界范围内得到广泛的临床应用。新的铂族抗癌药草酸铂、乙醇酸铂、乐铂等已推出，铂类药物的抗癌作用机制也有了进一步了解。铂类抗癌药顺铂进入细胞内后，由于细胞内的氯离子浓度低，它很快就发生水合解离，生成带正电荷的水合配离子，而四价铂在细胞内很不稳定，首先会被细胞内的抗氧化剂还原成二价，再发生类似水合解离反应。当顺铂水合解离形成[Pt(NH3)2(H2O)2]2+后，受DNA的静电吸引力，定向快速往细胞核迁移，到达靶目标。当它到达DNA键时，DNA键的碱基嘌呤（N7）取代配位水，在一股上相邻的鸟苷酸残基之间形成链内交联，形成cis-[Pt(NH3)2]/DNA加合物。加合作用改变了DNA正常复制模板的功能，引起DNA复制障碍，从而抑制癌细胞的分裂。铂族抗癌药与其它抗癌药一样，影响DNA合成的作用是非特异性的。它的铂化定位于DNA大沟区的乌嘌呤的N-7位，紧接着与第二个嘌呤作用，选择性地结合到d(pGpPG)和d(pApG)序列，形成了DNA的链间交联。

铂类抗癌药物的作用机制

多核铂抗癌药是一种全新结构的药物，它的设计摆脱了原有的构效关系框架。可以说是铂类抗癌药研究的重大发展。它与DNA发生多点键合，键合能力强，对DNA模型结构破坏更加严重。因此其抗癌活性明显高于顺铂，同时与顺铂无交叉耐药性，是一个具有重大开发前景的新药，目前正在进行临床研究。

(5)，金配合物

在铂类化合物抗肿瘤应用研究的基础上，人们又发现金的有机配合物也具有抗肿瘤活性，它们同样通过与DNA分子中碱基上N的共价配位，从而改变DNA正常复制模板的功能，引起DNA复制障碍而达到抗肿瘤的目的。

(3)，有机锡化合物

有机锡化合物同顺铂一样，可与DNA作用，但与DNA作用的模式却不同。一般认为，R2SnX2L2中，配合物在生理条件下可能通过双氮配体离去后与DNA作用，进而干扰DNA的模板作用，妨碍DNA的复制。

（4）氮芥类化合物氮芥(nitrogenmustard)类双功能生物烷化剂的抗癌作用是在DNA的碱基或磷酸基部位发生了烷化作用，形成交叉连结。烷化的DNA改变了构型或发生了断裂而丧失功能，起到杀伤癌细胞作用

（5）含有环氧烷的化合物如黄曲霉毒素，它是由一种名为黄曲霉菌生物体产生的一类毒素的总称，是多种结构相似的杂环混合物。在体内经过酶催化形成一种含有环氧烷的化合物可以与DNA结合。（6）isochrysohermidin（7）具有沟区作用的烷化剂含氯乙基类化合物氨茴霉素类二聚物4．断裂作用

DNA的断裂在DNA修复、转录及突变中是很重要的一个生物学过程。DNA断裂剂的研究是小分子与DNA分子识别研究中不可缺少的一部分。DNA断裂剂分为“合成的”和“天然的”两大类。(1)合成的DNA断裂剂

第一类为EDTA-Fe(II)类衍生物，包括EDTA-Fe(II)连接到典型的DNA嵌插剂乙锭及其类似物上，会产生特异的断裂功能；EDTA-Fe(II)连接到偏端霉素及其它有AT选择性的沟区结合分子上，可引起DNA特异性的AT富集区的断裂；EDTA-Fe(II)连接到富含嘧啶碱的寡聚核苷酸上，与DNA的双螺旋结构形成三螺旋，继而引起DNA的特异性定点切割。第二类为1，10-二氮杂菲(OP)的Cu(I)整合物，研究证实OP-Cu(I)结合在DNA的小沟区内对AT富集区有特异性的切割作用。第三类是以邻菲罗琳为配体的软酸性金属配合物，它可以和DNA发生一定程度的嵌插结合，在光照下对DNA有特异性断裂功能。(2)天然的DNA断裂剂

博来霉素(bleomycin，BLM)是轮枝链球菌发酵液中提取的氨基糖肽类抗癌抗生素。有一系列类似物，国外临床上用的是BLMA2，国内临床上用的是BLMA5。从结构上说BLM可以分为三个部分：能够与金属发生络合的嘧啶、

-氨基丙氨酸、

-羧基咪唑区；利于细胞转运的古罗糖和氨基甲酰甘露糖部分；与DNA识别并嵌插结合的双噻唑末端区。同源物的差别仅在末端区的胺基上。BLM中金属离子配位的部分是这种断裂试剂的核心。在有能与嘧啶-咪唑部分结合的铁离子和还原剂存在的情况下，博来霉素能以一种氧依赖方式引起DNA链的断裂。在DNA分子中被BLM断裂频率最高的是GpPy的序列，选择性为GpC＝GpT＞GpA＞GpG。对于BLM的抗癌机理虽仍有争议，但目前普遍为人们所接受的是：BLM通过分子中的双噻唑基与DNA结合后同体内的微量Fe(II)达到络合平衡，生成氧活性的Fe(II)络合物，该络合物随着Fe(II)的氧化而释放出某些氧的自由基，正是这自由基产生了对DNA的断裂作用。针棘霉素和生硝霉素第二类天然断裂剂是针棘霉素(esperamicine，EPM)和生硝霉素(calicheamicine，CLM)，它们都是作用很强的一类新型抗癌剂。它们是具有一个特殊的被称为“弹头”的l,5-二炔-3-烯系统，一个芳环部分和四个糖基的天然产物。针棘霉素和生硝霉素对各种小鼠的肿瘤却显示出很高的疗效；在巯基存在的情况下，连在药物弹头位置的三硫化合物部分会转变成一种硫醇阴离子；该阴离子通过一种内部Michael加成反应，最终将1,5-二炔-3-烯部分转变成能切割DNA的亚苯基双自由基。由于两种自由基同时经由单一活化过程所形成，因此活化后的药物分子能同时与相反的DNA链作用，产生双链断裂。用DNA测序方法进行的研究显示CMM系列化合物的断裂特异性要强于EPM。新制癌菌素新制癌菌素(neocarzinostatin，NCS)，NCS是一个含二炔-烯生色团的抗肿瘤抗生素，是由链霉菌属的培养液中分离得到的。含有一个具有生物活性的生色团和一个作为载体的，保护生色团在体内不受破坏的脱辅基蛋白。药物的原正电氨基通过静电引力与DNA磷酸骨架接近，随后是弹头嵌入到DNA碱基对之间。加入一种巯基辅助因子如二硫苏糖醇会使生色团的环氧基开环。然后再通过重排产生一种具有自由基中心的中间物，此双自由基产物被认为是药物的活性中心。用NCS进行切割时，碱基攻击反应顺序为T＞A＞C＞G。已证实有两类NCS-DNA加成物，一类不稳定的加成物可能涉及到与药物相连的去氧核糖部分。另一类对强酸处理分解仍保持稳定的共价加成物则是由于NCS某一个亚单位上的一个自由基和去氧核糖C-5’位的自由基的偶联。在共价加成物形成中也观察到了碱基选择性与在断裂机理研究中发现的选择性相同，说明两种作用机理都可能源于相类似的DNA部分。金属配合物过渡金属配合物与核酸间的反应引起核酸骨架发生断裂，其反应类型可分为两类：(1)涉及金属配合物的氧化还原反应，会引起核酸的氧化作用；(2)涉及金属中心与糖磷酸骨架的配位反应，会引起聚合物的水解作用。二肽断裂剂人工核酸切割试剂的切割机理主要有自由基机理和磷酸酯水解机理两大类。相对于水解机理而言，自由基机理有许多缺点，这使得自由基型核酸切割试剂在应用上受到很大的限制。对于DNA,虽然现在已经发展了许多人工切割试剂,但它们绝大多数都是通过自由基机理切割核酸的。目前能够以水解方式切割DNA的人工试剂还非常少，而且都与金属离子有关。带切割基团的寡聚酰胺在头针状寡聚酰胺的转折处接上1-氯甲基-5-羟基-1,2-二氢-3-Ｈ-苯并吲哚(SecoCBI)，发现烷基化几乎都发生在识别序列旁的腺嘌呤部位，并能进行有效的选择性切割。为了研究其选择结合性和生物活性，将SecoCBI换成4-双[(氯乙基)胺]苯丁酸(CHL)，发现寡聚酰胺的选择性和亲合性与连接CHL前没有变化。在低浓度下烷基化的产率很高。三、DNAG四链体的分子识别尽管含有G重复序列的DNA在体外Na或K的生理浓度下,可以很容易形成G-四链体结构,但在体内G-四链体的形成可能要复杂得多。因为,大多数含重复G碱基的基因组在细胞周期中通过碱基配对形成稳定的双链螺旋结构;其次,在体内DNA通常与特异或非特一性蛋白质结合在一起;再者,体外分子间G-四链体的形成需要较高的DNA浓度,这在体内不可能实现,况且在体内G-四链体的形成可能不需要如此高的DNA浓度。自从1991年Zahler等证实对K+离子稳定的G-四链体能抑制端粒酶的活性,G-四链体DNA已成为寻找端粒酶抑制剂的新靶点。在G-四链体结构的基础上,若干研究小组成功地设计和合成了与其相互作用的先导化合物,到目前已开发出几类化合物,且广泛研究了它们与G-四链体的相互作用。1，酰胺蒽醌类化合物蒽醌类化合物是发现较早的能够与DNA相互作用的化合物，具有广泛的抗肿瘤活性，并对三螺旋DNA有较高的选择性。1997年，Sun等报道了第一个以G-四链体为靶点的小分子端粒酶抑制剂-2,6-二酰胺蒽醌衍生物BSU1051(1)。该化合物能够稳定G-四链体结构(使分子间四链体d[T2AG3T]4的解链温度Tm升高了约20℃)，对端粒酶活性有抑制作用，采用引物端粒酶延伸技术得到其IC50值(抑制50%端粒酶活性的有效浓度)为23μmol/L

Perry等系统地研究了蒽醌类化合物的结构与端粒酶抑制活性的关系，他们合成了近100个1，4-、1，5-、1，8-、2，6-及2，7-取代的酰胺蒽醌化合物，并采用改进的TRAP-PCR方法测定了这些化合物对端粒酶的抑制活性。其中一些化合物的IC50值达到1～5μmol/L，是目前所报道的活性较强的物质。虽然酰胺蒽醌类化合物具有较高的端粒酶抑制活性，但由于其能与双链DNA作用，因此细胞毒性较高。

2,芴酮类化合物

为了减小化合物的细胞毒性，Perry等[10]对芴酮类化合物(2)进行了研究。其中活性最高的化合物的IC50值在8～12μmol/L。分子模拟研究表明，其原因是芴酮中心为五元环，分子结构接近弯月型，两条侧链与四链体沟槽结合时，引起了四链体结构的扭曲。3，阳离子型卟啉类化合物

由于卟啉类化合物在肿瘤组织中能积蓄达到较高的浓度，而在正常组织中却很快代谢，长期以来，它们在肿瘤治疗方面倍受关注。卟啉芳香环平面与G-四方体大小接近，研究人员据此推测，该类化合物能通过与G-四方体的堆积作用同四链体结合。

阳离子型卟啉化合物中活性较高且研究较多的是TMPyP4四(N-甲基吡啶-2-基)卟啉，5)。TMPyP4对G-四链体有一定的选择性，其对四链体的亲和性是对双链DNA的2倍。TMPyP4不仅能与G-四链体结合，而且能通过这种作用浓度和时间依赖地抑制MCF7细胞端粒酶活性，而对正常细胞则影响不大。采用引物延伸技术得到其IC50值为6.5±1.4μmol/L。

4，芘类化合物

芘类化合物是应用计算机辅助药物设计软件DOCK而得到的一类与G-四链体有较强相互作用的化合物。在分子模拟的基础上，Fedoroff等合成了N,N′-双[2-(1-哌啶基)乙基]-3,4,9,10-芘四甲酰二亚胺(PIPER，6)。实验证实，这是一种与G-四链体有强特异性相互作用的化合物，与单、双链DNA之间的作用微弱，并具有良好的端粒酶抑制活性(IC50=40μmol/L)。该化合物的显著特点是能促进G-四链体的形成。5，吖啶类化合物

吖啶类化合物与蒽醌结构也相近，但其对端粒酶的抑制活性比蒽醌高，分子模拟研究表明这是由于吖啶稠环中的N原子能质子化，带一定正电荷，从而使其更准确地堆积在G-四方体的中心位置，与四方体平面的负电荷产生静电相互作用。

根据双螺旋DNA与G-四链体沟槽数目及负电荷位置的不同，Martin等用计算机建模，设计并合成了一系列3，6，9-三取代吖啶。这类化合物与G-四链体在结合时能更好地吻合，选择性地与G-四链体作用，抑制端粒酶的活性。其中化合物10对G-四链体的亲和性比对双链DNA高30倍，对端粒酶活性的抑制效果明显，IC50值达到0.06μmol/L。甲基化五环喹诺吖啶盐是一类新的具有端粒酶抑制活性的化合物，其中11和12的活性较高，IC50值分别为0.25μmol/L和0.33μmol/L。6，溴乙啶衍生物

溴乙啶是强效的双链DNA嵌入剂，Guo等认为其可以与d(T4G4)4形成的四链体结合，而且亲和性略高于双链DNA。但另有实验证实，溴乙啶对三螺旋DNA的亲和性明显高于G-四链体。然而一系列溴乙啶衍生物对G-四链体结构却具有较高的亲和性和选择性，它们不仅能够提高分子内四链体的解链温度，而且能够促进分子间四链体的形成。此外，这些化合物与四链体结合后荧光增强，可以作为四链体结构的荧光探针。其中化合物13对四链体的灵敏度很高，能够检测到0.1μg以下的四链体DNA的存在。该类化合物同时具有较高的端粒酶抑制活性，TRAP法测得的IC50值在0.018～0.1μmol/L之间，化合物14的活性最高。7，二苯邻二氮杂菲衍生物

实验发现，二苯邻二氮杂菲衍生物在浓度为1μmol/L时，能够将G-四链体的解链温度提高2～20℃，其中活性最高的两种化合物15和16的解链温度分别提高了19.7℃和12.5℃。解链温度的提高与体外端粒酶抑制活性呈明显的对应关系，解链温度越高，对端粒酶的抑制活性越强，TRAP法所得的化合物15和16的IC50值为分别达到0.028μmol/L和0.5μmol/L。8，花青染料类化合物

DTC(19)能够与分子内G-四链体结合，并抑制端粒酶活性。DTC对G-四链体的亲和性、选择性以及抑制端粒酶的活性表明，其不适合用于肿瘤的治疗。但花青染料DODC(3，3′-二乙基氧杂花青，18)与双分子发夹型G-四链体结合时，能够显示出独特的光谱特征，而与单链、双链或平行型G-四链体结合时则无此特征，因此可以作为发夹型G-四链体的特殊探针。

9，三吖嗪衍生物

提高G-四链体解链温度的三吖嗪衍生物(22，23)，在15种永生化细胞中的实验证明，这两种衍生物能够抑制端粒酶活性，并且端粒酶活性的抑制与化合物对四链体的亲和性之间呈对应关系。肿瘤细胞在该类化合物中长期培养，会导致端粒的缩短和细胞衰老，这种现象与起始的端粒长度有关。

10，氟代喹诺吩恶嗪

FQP(25)是在氯代喹诺苯并恶嗪(24)的基础上设计合成的新型端粒酶抑制剂，其端粒酶抑制活性高于22，而对拓扑异构酶完全没有毒性(24对拓扑异构酶具有较高的毒性)。三、其他DNA结构的分子识别三螺旋DNA的稳定性取决于寡聚核苷酸序列的组成和长度,而且与溶液环境有关。溶液pH的改变、抗衡离子、分子嵌入试剂和共聚物的存在都会影响三螺旋DNA的稳定。一般来说,T·A*T三碱基体的含量越高,三螺旋DNA越稳定。富含C·G*C三碱基体的三螺旋DNA的稳定性强烈地依赖于环境值,低pH环境有利于三螺旋DNA的稳定。由于三螺旋DNA磷酸骨架的负电荷密度高,相应的抗衡离子,如金属阳离子和聚多胺的存在是十分重要的。溴化乙锭、吖啶和亚甲基蓝等分子嵌入试剂能使双螺旋DNA的融链温度升高,也能与三螺旋DNA发生嵌入作用而增强其稳定性,使三螺旋DNA在生理环境下稳定存在。某些共聚物也能增强三螺旋DNA的稳定性。如在梳型共聚物存在时,嘧啶型三螺旋DNA在生理pH时的结合常数比无稳定剂存在时提高约100倍。凸起结构的识别junction-bindingligand第二节RNA的分子识别

现代新药研究与开发离不开筛选模型，而筛选模型的关键是寻找、确定和制备药物筛选靶---分子药靶。选择确定新颖的有效药靶是新药开发的首要任务。传统的小分子药靶多是蛋白质，近年来的研究表明同DNA的双螺旋结构相比，RNA结构具有令人惊奇的复杂性和多样性，同蛋白质一样形成复杂的三级结构，RNA的三级结构作为分子相互作用的识别位点和结合位点对RNA的生物功能的实现具有重要决定作用。RNA分子同蛋白质一样将成为新型小分子药物的作用靶点，为制药业提供了新的机遇。

一、RNA的结构与DNA相比，RNA种类较多，分子量相对较小，在遗传信息表达和调控过程中各类RNA分别发挥作用。随着研究的深入，人们发现生物体内RNA的种类和功能已远远超出从前对它的认识，不仅仅是在基因表达时作为中介那样简单，它在生命活动的各个方面和生物进化过程中起着相当重要的作用。

一、生物体内RNA的种类目前看来，生物体内有14种以上的RNA类型：(1)信使RNA(mRNA)，携带从DNA转录来的遗传信息。(2)转运RNA(tRNA)，负责蛋白质合成时氨基酸的转运。(3)核糖体RNA(rRNA)，在核糖体中起装配和催化作用。(4)具有催化作用的RNA，即核酶(ribozyme)和其它RNA自我催化分子。(5)基因组RNA(genomeRNA)，指一些病毒以RNA为遗传物质(6)指导RNA(guideRNA)，是指导RNA编辑的小RNA分子。(7)mRNA样非编码RNA，其转录和加工方式同mRNA，但不翻译为蛋白质。已知这类RNA有20多种，例如人的xistRNA和X染色体的XIST结合，使此X染色体失去转录活性。(8)tmRNA，本身既是tRNA又是mRNA，翻译时一身二任。如大肠杆菌中的10SaRNA。

(9)小胞质RNA(small

cytoplasmicRNA，scRNA)，存在于细胞质中的小RNA分子。如信号识别颗粒(signalrecognitionparticle，SRP)组分中含有的7SRNA。(10)小核RNA(smallnuclearRNA,snRNA),是剪接体的组分。(11)核仁小RNA(small

nucleolarRNA，snoRNA)，参与rRNA的加工。(12)端粒酶RNA，是真核生物端粒复制的模板。(13)反义RNA(antisenseRNA),可通过与靶位序列互补而与之结合的RNA，或直接阻止靶序列功能,或改变靶部位构象而影响其功能。(14)小RNA(smallRNA)，作为基因表达的抑制子。包括小干扰RNA(shortinterferingRNAs,siRNA)、小时序性RNA(smalltemporalRNAs,stRNA)、小非编码RNA(tiny

noncodingRNA)、微小RN(microRNAs,miRNA)等。主要包括siRNA和miRNA两大类。另外,在DNA复制过程中的引物也是RNA，因其不单独存在并很快降解，未将其作为一类。RNA结构的特征（1）双股螺旋，是RNA分子中的双链区，为A型右手螺旋；（2）发夹环，为与螺旋一端两条链连接的非配对的单链区。由双股螺旋及与其连接的发夹环共同构成的结构称为茎环结构；（3）单碱基突起及突环，单碱基突起即在一个连续的螺旋中间突出的一个碱基，如果有连续的碱基突起则称为突环；（4）内部环，为隔开或连接2个螺旋的环区；（5）接合环，是连接3个以上螺旋的环区，也称为支环；（6）单链区，常出现在RNA分子的端部。RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G除了可以和C配对外，也可以和U配对。G-U配对形成的氢键较弱。RNA功能的多样性，归因十它可以通过大量的二级结构和三级结构的相互作用，而体现出复杂的三维立体空间结构。尤其是其结构和功能基团的空间伸展、RNA折叠产生的静电场等共同产生了可以和小分子、蛋白质结合的潜在作用口袋。(A)duplex,(B)hairpinloop,(C)single-basebulge,(D)multiple-basebulge,(E)symmetricinternalloop(2:2),(F)asymmetricinternalloop(3:2),(G)mismatchloop,(H)three-stemjunction,and(I)four-stemjunction.InterferingwithmiRNAexocrinefunction.

miRNAregulationofinsulinsignallingandglucosehomeostasis.

二，RNA识别的小分子药物

RNA的一个显著特征是它能折叠成复杂的三维结构,包含环、突起、假结和翻转。这些结构使得RNA分子在细胞中具有不同功能。从这一方面来讲，RNA比DNA更像蛋白质，后者缺乏柔韧性和多种不同的三级结构。各种不同RNA靶标所具有的独一无二的结构为小分子提供了潜在的结合位点。目前，以RNA为作用靶的药物研究主要包括两大类：一是传染性疾病---新型抗菌和抗病毒药物研制；另一类是非传染性疾病