DNMT3B基因启动子C46359T多态性与食管癌易感性的关联分析-0

1/1DNMT3B基因启动子C46359T多态性与食管癌易感性的关联分析DNMT3B基因启动子C46359T多态性与食管癌易感性的关联分析DNMT3B基因启动子C46359T多态性与食管癌易感性的关联分析【摘要】目的：

探讨DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性与江苏汉族人群食管癌易感性的关系。

方法：

提取195例食管癌患者及１89例健康体检人员外周血基因组DNA，采用PCRRFLP结合DNA测序技术检测DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性。

结果：

正常对照DNMT3BC46359T等位基因TT/CT基因型频率为%/%,病例组为%/%，在对照组与病例组中均未匍检测到DNMT3B463虫59CC基因型。

携带DN盆MT3B46359CT等位基因的个体与对照组相比蝽，其患食管癌的易感性未见あ明显升高(Ｐ=,OR=，95%CI：

～)。

对比江啵苏汉族人群和英国、美国白凤种人群，DNMT3BC4鲒6359T单核苷酸多态性欤频率分布有明显差异(Ｐ【痢关键词】DNA甲基转移池酶3B食管癌单核苷酸多态搛性肿瘤的病因学，尤其是冕其与某些遗传性疾患关系的氡研究已表明,大多数人类恶性肿瘤是由环境因素作用于昆遗传物质的结果［1］，遗鹇传因素越来越被认为是癌症佧发病风险的主要因素之一［科23］。

尽管有些基因突变可以导致肿瘤，但是对于寮大多数人来说，患肿瘤的风险可能来自于相对常见的低喧外显率的疾病相关多态性的微差异［3］。

肿瘤不仅是遗筢传性疾病，同时也是由基因羟转录沉默所引起的表观遗传梨性疾病。

在一些人类肿瘤细阒胞中，启动子区CpG岛的鳘重新甲基化可能是肿瘤抑制镭基因失活的机制［4］。

D舳NA甲基化的异常是最常见的表观遗传学改变，DNA嗟甲基化是由一组DNA甲基≌转移酶(DNAmethyltransferase就，DNMT)家族催化的，钰目前在哺乳动物中确定的D缘NMT有DNMT1、DN一MT3A和DNMT3B［腱57］。

其中，DNMT岬1主要负责维持甲基化，而党DNMT3A和DNMT3哐B主要负责重新甲基化［6珲，8］。

DNMT3B在肿镖瘤形成过程中起重要作用，鉴已经发现在肿瘤细胞中存在DNMT3B的高表达［5痣］。

DNMT3B基因定位港于20号染色体，在距转录蝼起始位点-149碱基对的科启动子区含有CT转换多诞态性，体外实验表明，该位寮点的转换可以使DNMT3B启动子的活性增加30%［9］。

食管癌是世界上趸最常见的恶性肿瘤之一，其派发病率在发展中国家居第5位，我国的食管癌死亡率居┖世界首位［10］。

早期食狠管癌经手术切除后5年生存爷率可达90％以上，而中晚璞期患者仅为6％～15％［踉1112］。

如果能够做猃到早期诊断或易感风险评估熄，则有可能降低食管癌的死亡率。

本研究选择江苏地区竹汉族人群，探讨DNMT3速B基因C46359T位点蘑基因多态性与该地区人群食霪管癌遗传易感性之间的关联旺。

1材料和方法材嫱料病例组选自XX年2月襻～XX年7月在江苏省肿瘤呸医院、南京军区南京总医院保存的食管癌病人血液样本雪195例，其中男153例遨，女42例，所有病例临床资料完整。

血液标本采集前均未有抗肿瘤药物使用记录笺。

对照组为健康人血液样本阌189例，其中性别、年龄匡等均与病例组相匹配，男1沧35例，女54例,见表1Ю。

两组人群均系江苏地区汉绵族人群，个体之间均无血缘炖关系。

方法基因组耵DNA抽提采集静脉全血2ml，乙二胺四乙酸二钾鹆(EDTAK2)抗凝，曦常规蛋白酶K消化后苯酚／硬氯仿抽提，乙醇沉淀法提取基因组DNA［6］，总共涤提取食管癌患者、健康正常人外周血DNA384例，滏提取的DNA溶解于TE中荒，4℃保存。

表1病例组岽与对照组样本间年龄和性别辖分布频率比较例注：

括弧忙中为所占百分比PCR胳PCR引物序列见文献［1楮3］，上游5TGCT崧GTGACAGGCAGA瘐GCAG3(nt46稃15146170)，下盥游5GGTAGCCG吕GGAACTCCACGG页3(nt46530酰46511)，扩增产物3慵80bp。

25l反应体系含dNTPsL-1，承上下游引物各10pmol噢，TaqDNA聚合酶1．嗟25U，l(100ng匡)，L-1。

95℃预变摩性5min；95℃30s红，69℃30s，共32个寨循环，最后72℃延伸10险min。

PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭矿染色观察。

限制性内切嫂酶BlnⅠ酶切反应20蛛l酶切反应体系含10科KBufferl，Bl炯nⅠ(TaKaRa公司)4U，PCR产物l，混米匀后37℃水浴中酶切过夜♀。

酶切产物于％琼脂糖凝胶廨电泳分析基因型。

DN俣A序列测定选择凝胶电泳溜证实为CT基因型、TT基蹯因型各2例，由南京金思特公司经双脱氧链终止法测序。

统计学处理采用SPSS13．0统计软件进踉行卡方检验，计算Ｐ值、O筅R值和95%CI。

2惜结果一般资料的统计学译检验经双侧卡方检验，在病例与对照组中，年龄在40～60岁和60岁的分谩别为%/%和%/%，男、〖女分别为%/%和%/%，蟮均无统计学差异，见表1。

DNMT3B启动子C根46359TPCR产物分鼗析PCR产物为380b铧p的片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果见图1。

经限凋制性内切酶BlnⅠ酶切后，当nt46359处为T洄时，BlnⅠ可将PCR产津物切为207bp和173庥bp两个片段；当nt46359处为C时，BlnⅠ沧不能将PCR产物切开，只榇有1个380bp的片段；淄当nt46359处为CT时，为380bp、207耵bp和173bp3个片段燥，见图2。

为证实酶切结果骜，将凝胶电泳证实为CT基因型、TT基因型各2例P殊CR产物送至测序公司进行克测序，其中箭头所示为DN狄MT3B启动子C4635沾9T多态性位点，见图3。

醮DNMT3BC46359T等位基因频率在病例湘组和对照组中的分布经Ha凼rdyWEinberg杈遗传平衡吻合度检验，病例弭和对照组的基因型分布符合遗传平衡定律。

结果显示，脉正常对照中DNMT3BC洙46359T等位基因TT鲩/CT基因型频率为%/%,T的频率为%，C的频率腊为%；病例组中TT/CT胼基因型频率为%/%,T频率为%，C的频率为%。

经2检验，DNMT3BC迟46359T等位基因TT呷/CT基因型频率在正常人群和食管癌患者中分布差异饲没有显著性(P=)，对照组与病例组中均未检测到D纨NMT3B46359CC累基因型。

见表2。

注：

括弧钯中为所占百分比DNMT置3BC46359T等位基漓因频率在中国汉族人和英国泓、美国白种人中的分布经与咬文献报道的DNMT3BC炉46359T等位基因频率兖分别在英国和美国白种人［赳9，14］之间比较，显示泊英国、美国白种人中TT、隍CT和CC基因型分别占%划/%/%和%/%/35%卞，而中国汉族人TT和CT摅基因型分别为%和%，中国容汉族人DNMT3BC46359T等位基因频率分布莹与英、美两国白种人存在显缵著的统计学差异，见表3。

轱3讨论单核苷酸多态雍性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的凿DNA序列多态性，在人群毹中的频率大于1％,是人类ｈ可遗传变异中最常见的一种睿，占所有已知多态性的90秣％以上［15］。

SNP与リ肿瘤等许多疾病的易感性有悃关［16］。

研究表明，位才于基因启动子区的SNP能蹩影响基因的表达或酶的活性式［1314］。

DNA甲侔基化在胚胎发育和印迹基因察的转录抑制，如X染色体的失活以及许多人类肿瘤中重⒓要基因的异常沉默中起重要锰作用［17］。

DNMT3B基因启动子区-149位C46359T多态性与乳恣腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱ヨ癌以及急性白血病等多种肿灵瘤易感性有关［9，14，聍1820］。

这些研究提ш示该位点的遗传变异可能与多种肿瘤发病风险相关，该圯位点可能作为评价人群肿瘤易感性的一个指标。

到目前蓍为止，C46359T是否敲与食管癌易感性有关尚不清乒楚。

表3DNMT3B基宵因启动子区C46359T电等位基因频率注：

括弧中为所占百分比食管癌是我国常见的一种消化道肿瘤，因其缺乏有效的早期诊断指标，俸当患者出现症状时往往为中尴晚期，不利于治疗，且预后钼不良。

为了给食管癌提供一熨个早期诊断指标，我们对D扪NMT3B基因启动子区上届游149位C46359T挚多态性与食管癌的易感性进嵊行了研究。

本研究所得DN敌MT3B基因启动子区-1怪49位点基因型分布结果符绱合HardyWeinb瘅erg平衡定律。

正常对照组中TT基因型为%，CT镰基因型为%，病例组中分别宇为%和%，两者无显著的统羼计学差异(P=,OR=，烫95%CI为～)。

这说明诒至少在我们的研究中，DN巧MT3B基因启动子区上游瓤149位C46359T多瘕态性与食管癌易感性之间可纪能无显著的相关性。

这有可觌能是由于在不同的细胞组织焦中DNMT3B的不同剪切ｃ子催化活性有差异［8］，仞或者是DNMT3B活性的涨抑制不能使一些细胞系中高蝼甲基化的肿瘤抑制基因激活［2122］，而且在不槠同肿瘤中，C和T所代表的疹风险因素也不同，如在肺癌珩中，DNMT3BC463哼59T的CT+TT基因型鄂所患风险几乎是CC基因型烀的两倍［20］；而在乳腺砉癌中，CT+CC基因型风，险率显著高于TT基因型［9］，这说明在不同的肿瘤鲁中DNMTs作用的复杂性镊。

本研究结果还显示中国汉碱族人的基因型分布与英国、斛美国白种人有显著不同。

有蜓关中国人群该位点的研究结孪果发现，此CT基因型在中蹯国汉族为%［16］,北方ケ地区为%［19］，正常对扼照组中均未检出CC基因型畎，这种分布的显著差异的机制还没有明确。

DNMT3镜B多态性的生物学功能，以筢及其在肿瘤发生过程中的作殍用还有待进一步研究。

此位点与食管癌易感性的相关性淌还需要在其他种族中进行研究。

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