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文档简介
1/1ARL6IP5基因在原发性肝癌中的生物学作用分类号:
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内部研究生学位论文论文题目(中文)ARL6IP5基因在原发性肝癌中的生物学作用论文题目(外文)BiologicalfunctionofARL6IP5inprimarylivercancer研究生姓名胡泽楠学科、专业内科学消化内科学研究方向消化系肿瘤学位级别博士导师姓名、职称周永宁、乔梁教授论起文止工年作月2009年12月至2012年12月论文提交日期2013年4月论文答辩日期2013年5月学位授予日期校址:
甘肃省兰州市原创性声明本人郑重声明:
本人所呈交的学位论文,是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。
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I英文缩写索引缩写英文全称中文全称APCallophycocyanin别藻蓝蛋白APSammoniumpersulfate过硫酸铵bpbasepair碱基对BrdU5-Bromo-2’-Deoxyuridine5-溴脱氧尿嘧啶核苷BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白CFUcolonyformingunit克隆形成单位cDNAcomplementaryDNA互补DNAddH2Odoubledistilledwater双蒸水DENdiethylnitrosamine二乙基亚硝胺DIH2Odeionizedwater去离子水3dH2O3rddistilledwater三蒸水DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸DPBSDulbecco’sphosphatebufferedsaline杜氏磷酸盐缓冲液DTTdithiothreitol二硫苏糖醇ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定ERKextracellularsignal-regulatedkinase细胞外信号调节激酶FACSfluorescenceactivatedcellsorting荧光激活细胞分选术IIFBSfetalbovineserum牛胎儿血清GSHglutathione谷胱甘肽HCChepatocellularcarcinoma原发性肝细胞肝癌HCVhepatitisCvirus丙型肝炎病毒JFH1Japanesefulminanthepatitisclone1日本爆发性肝炎病毒1型克隆(HCV核心蛋白)JNKjunN-terminalkinase氨基末端激酶KDkiloDalton千道尔顿MAPKmitogen-activatedproteinkinase促分裂原活化蛋白激酶mRNAmessengerRNA信使RNAminminute(s)分钟PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PIpropidiumiodide碘化丙啶RNAribonucleicacid核糖核酸rpmrevolutionsperminute转/分ssecond(s)秒SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠TEMEDtetramethylethylenediamine四甲基乙二胺Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷IARL6IP5基因在原发性肝癌中的生物学作用中文摘要目的:
探讨ARL6IP5在肝癌,特别是丙型肝炎相关性肝癌的形成过程中的生物学功能。
为肝癌的诊断与治疗提供新思路和策略。
方法:
收集人肝癌组织8对(HCV阳性4对,HCV阴性4对)。
急性和慢性DEN处理(急性处理,一次性单剂量腹腔内注射150mg/kgDEN,6天;慢性处理,一次性单剂量腹腔内注射50mg/kgDEN,48周)小鼠,诱导肝损伤和肝癌动物模型。
获得小鼠肝癌组织及小鼠非癌肝组织共54例,经实时荧光定量PCR(qPCR)和westernblot方法检测ARL6IP5的表达情况。
给Huh7细胞转染HCV核心蛋白JFH1,用qPCR和westernblot方法检测被转染细胞中ARL6IP5的表达情况。
选用HCV相关肝癌细胞株Huh7和永生化肝细胞MIHA,用小分子RNA干扰技术(siRNA-ARL6IP5)沉默ARL6IP5基因,然后检测该基因沉默后对细胞增殖能力、侵袭能力、克隆形成能力和细胞凋亡的影响。
同时检测该基因沉默后对其他主要的信号通路如MAPKs(pERK1/2、pP38和pJNK)是否产生影响。
选用Huh7和MIHA细胞株构建基因ARL6IP5过表达稳定细胞株,以空载体表达稳定细胞株为对照,在这些细胞中进行上述功能实验。
结果:
人肝癌组织中ARL6IP5的平均表达水平明显高于癌旁组,同时HCV阳性的肝癌组织中ARL6IP5的表达明显高于HCV阴性组。
在给小鼠给予短期DEN处理后,小鼠肝组织中ARL6IP5的表达升高。
DEN慢性处理(即给予DEN后~48周左右)小鼠中,多数出现肝肿瘤。
利用westernblot检测,发现小鼠的肿瘤组织中ARL6IP5的表达明显高于非癌肝组织。
在Huh7细胞感染HCV核心蛋白JFH1之后,ARL6IP5的表达也明显增高。
细胞功能实验显示,ARL6IP5沉默后,Huh7与MIHA细胞的增殖、迁移、克隆形成能力及侵袭能力均明显降低,细胞凋亡增加,尤其早期凋亡增加明显,同时,MAPK信号通路中磷酸化ERK1/2(pERK1/2)与磷酸化p38(p-p38)表达均发生上调。
以上结果均显示出显著的统计学差异(P<0.05)。
相比之下,在ARL6IP5稳定过表达的Huh7与MIHA细胞,观察到与上述相反的改变趋势,即细胞的增殖、迁移、克隆形成能力及侵袭能力有所增加,而细胞凋亡减少,但实验组与对照组结果无统计学差异。
结论:
我们首次证实ARL6IP5可能是一种新的癌基因。
我们推断,在正常生理状况下,该基因就具有潜在的癌基因生物学特性,当受到致癌因素刺激,如丙型II病毒性肝炎感染后,该癌基因有可能活化,通过促进细胞增殖,细胞迁移,侵袭,抑制凋亡等作用参与细胞的恶性转化。
目前的研究结果为未来进一步在体内实验明确证实该基因是否为致瘤癌基因研究奠定了理论依据和基础,也为人类肝癌特别是HCV相关肝癌诊断和治疗提供新思路和治疗靶点。
关键词:
ARL6IP5,肝癌,HCV,JFH1IIIBiologicalfunctionofARL6IP5inprimarylivercancerAbstractAim:ToexaminethebiologicalfunctionofARL6IP5inlivercancer,withaparticularemphasisonHCVinducedlivercancer.Methods:Eightpairsofhumanlivercancertissues(fourpairsareHCVpositive,andfourpairsareHCVnegative)werecollectedfromWestmeadHospital,TheUniversityofSydney,Australia.54Livertissuesfromdiethylnitrosamine(DEN)treatedC57mice(includingacutetreatment,DENsingledose150mg/kg,6days,andchronictreatment,DENsingledose50mg/kg,48weeks)wereobtainedfromtheStorrLiverUnitoftheWestmeadMillenniumInstitute,theUniversityofSydney,Australia.TheexpressionofARL6IP5inthesetissueswasexaminedbyreal-timequantitativePCR(qPCR)andwesternblot.TheexpressionofARL6IP5wasalsoexaminedbyqPCRandwesternblotinhumanlivercancercelllineHuh7cellsafterbeingtransfectedwithHCVcoreproteinJFH1.ThebiologicalfunctionofARL6IP5wasfurtherexaminedinHuh7cellsandanimmortalizedhumanhepatocytesMIHAinwhichARL6IP5wassilencedbysmallinterferingRNA(siRNA)againstARL6IP5(siRNA-ARL6IP5),orARL6IP5wasover-expressedviastabletransfection.TheimpactofARL6IP5modulationoncellproliferation,migration,colonyformation,invasion,andapoptosiswasexaminedbyBrdUcellproliferationassay,woundhealingassay,colonyformationassay,chamberinvasionassay,andFACScananalysis,respectively.Meanwhile,theimpactofARL6IP5ontheexpressionofotherimportantsignalingpathwaygenes,includingpERK1/2,pP38andpJNKwereexaminedbywesternblot.Results:HigherexpressionlevelofARL6IP5wasfoundinHCCtissuescomparedtonon-canceroushepatictissues.Furthermore,HCVpositiveHCCtissuesexpressedamuchhigherlevelofARL6IP5thaninHCVnegativeHCCtissues.TreatmentofC57micewithasingledoseofDENforsixdaysledtoatransientincreaseintheexpressionofARL6IP5intheliver.Approximately48weeksafterasingledoseofDENtreatment,themajorityofmicedevelopedlivercancers,andthehepaticexpressionofARL6IP5inthesecancertissueswasmuchhigherthaninnon-cancerouslivertissues.TransfectionofHuh7cellswithHCVcoreJFH1ledtoamarkedincreaseintheexpressionofARL6IP5,asexaminedbyqPCRandwesternIVblot.FunctionalstudiesshowedthatsilencingofARL6IP5bysiRNA-ARL6IP5ledtoadecreasedcellproliferation,migration,colonyformation,andinvasion,butincreasedapoptosis.Thesechangeswereassociatedwithanup-regulationofpERK1/2andpP38.Statisticallysignificantdifferenceswerefoundfromalltheaboveresults(P0.05).Incontrast,stablyover-expressingARL6IP5inHuh7andMIHAcellsledtoanincreasedcellproliferation,migration,andinvasion,butareducedapoptosis,althoughthesechangesdidnotreachstatisticsignificance.Conclusion:ThesefindingsstronglysupportanoncogenicroleofARL6IP5inlivercancerformation.Inparticular,ARL6IP5maybeanimportantmediatorforHCVinducedhepatocarcinogenesis.WespeculatethatinresponsetocertainstimulisuchasHCVinfection,thereisanactivationofARL6IP5signaling,whichmightfacilitatethemalignanttransformationoftheinjuredlivercellsviaincreasingtheirabilitytoproliferate,migrateandinvade.Thesefindingsnotonlyhelpusbetterunderstandthemechanismsoflivercancerformation,particularlyhowHCVinduceslivercancer,butalsosuggestthatARL6IP5maybeofpotentialvalueasatherapeutictarget.Morestudiesinlargenumberofclinicalsamplesandrobustanimalmodelsarewarranted.Keywords:ARL6IP5,livercancer,HCV,JFH1兰州大学博士学位论文ARL6IP5基因在原发性肝癌中的生物学作用1目录中文摘要IAbstractIII目录1前言第一部分ARL6IP5在肝癌组织及Huh7JFH1细胞中的表达错误!未定义书签。
错误!未定义书签。
1.1实验材料错误!未定义书签。
1.1.1组织标本、细胞株和主要试剂错误!未定义书签。
1.1.2相关溶液的配制错误!未定义书签。
1.1.3相关仪器设备错误!未定义书签。
1.2实验方法错误!未定义书签。
1.2.1细胞的培养、冻存与复苏错误!未定义书签。
1.2.2组织标本的收集错误!未定义书签。
1.2.3实时荧光定量PCR检测错误!未定义书签。
1.2.4WesternBlottingAssay(蛋白免疫印迹实验)检测错误!未定义书签。
1.2.5统计学分析与处理错误!未定义书签。
1.3实验结果错误!未定义书签。
1.3.1实时荧光定量PCR检测ARL6IP5在RNA水平的表达情况错误!未定义书签。
1.3.2Westernblot检测基因ARL6IP5在蛋白水平的表达情况错误!未定义书签。
1.4结论及其意义错误!未定义书签。
第二部分ARL6IP5在人肝癌细胞株Huh7中的生物学功能错误!未定义书签。
2.1实验材料错误!未定义书签。
2.1.1组织标本,细胞株和主要试剂错误!未定义书签。
2.1.2相关溶液的配制错误!未定义书签。
2.1.3相关仪器设备错误!未定义书签。
2.2实验方法错误!未定义书签。
兰州大学博士学位论文ARL6IP5基因在原发性肝癌中的生物学作用22.2.1细胞增殖实验(BrdU)错误!未定义书签。
2.2.2细胞划痕愈合实验错误!未定义书签。
2.2.3平板细胞克隆形成实验错误!未定义书签。
2.2.4肿瘤细胞侵袭转移实验错误!未定义书签。
2.2.5流式细胞分选实验错误!未定义书签。
2.2.6小分子RNA干扰技术(siRNA)错误!未定义书签。
2.2.7质粒DNA的扩增、抽提与转染错误!未定义书签。
2.2.8实时荧光定量PCR与WesternBlottingAssay检测错误!未定义书签。
2.2.9细胞的培养、冻存与复苏错误!未定义书签。
2.2.10统计学分析与处理错误!未定义书签。
2.3实验结果错误!未定义书签。
2.3.1稳定细胞株的鉴定结果错误!未定义书签。
2.3.2siRNA-ARL6IP5基因沉默的鉴定结果错误!未定义书签。
2.3.3细胞增殖实验(BrdU)错误!未定义书签。
2.3.4细胞划痕愈合实验错误!未定义书签。
2.3.5细胞克隆形成实验错误!未定义书签。
2.3.6肿瘤细胞侵袭转移实验错误!未定义书签。
2.3.7流式细胞分选实验错误!未定义书签。
2.3.8Westernblot检测错误!未定义书签。
2.4结论及其意义错误!
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