3.2基因工程的基本操作程序第二步（第四课时）课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章基因工程3.2基因工程的基本操作程序第二步基因表达载体的构建1基因工程培育抗虫棉的思路：苏云金杆菌提取Bt抗虫蛋白基因导入棉花细胞抗虫棉Bt基因表达2获得目的基因后能直接转入受体细胞吗？

不能，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。一、作用①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代;②使目的基因在受体细胞中能够表达和发挥作用。“基因表达载体”和“载体”有什么不同？如何构建？4二、原理：基因的表达

和体内基因的表达一样，外源基因在受体细胞中也会经历复制、转录、翻译三个重要环节。

拓展资料知识：原核生物基因结构非编码区组成：编码区上游与编码区下游功能：不能编码蛋白质，调控基因的表达启动子：RNA聚合酶结合位点转录起始终止子：终止RNA的合成UTR:非翻译区编码区：编码蛋白质的合成3’UTR5’UTR编码区终止子启动子5’3’3’UTR5’UTR起始密码子终止密码子非编码区非编码区5’3’DNAmRNA转录翻译蛋白质mRNA前体（pre-mRNA）成熟mRNA拓展资料知识：真核生物基因结构转录加工DNA3’UTR5’UTR编码区终止子启动子5’3’5’UTR起始密码子终止密码子非编码区非编码区5’3’外显子1外显子2外显子3内含子1内含子23’UTRAAAAA5’UTR3’UTRAAAAA3’5’翻译蛋白质加帽剪接加尾7二、原理：基因的表达

①转录②翻译转录起始→mRNA的延伸→转录终止mRNA→翻译起始→多肽链的延伸→翻译终止（启动子）

（终止子）（mRNA上的起始密码子）

（mRNA上的终止密码子）三、构建表达载体①启动子基因的上游，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA③终止子：②限制酶切割位点基因的下游，能终止mRNA的转录⑤标记基因作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来④复制原点DNA复制的起始位点有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子基因克隆载体必须具备的条件标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点基因表达载体必须具备的条件基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点的序列。载体可以分为克隆载体和表达载体101．COR基因是植物的冷调节基因，其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害，具有增强植物抗寒性的作用。转录因子CBF（由CBF基因控制合成）能够特异性结合下游靶基因启动子区，从而激活COR基因的表达以提高植物的抗寒性。将不同植物中获取的CBF基因和COR基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体，转入植物体内能有效提高植物的低温耐受性。构建基因表达载体时需要根据载体和目的基因上的限制酶切割位点选择不同的限制酶。(2)抗寒相关基因超量表达依赖于适宜的启动子。启动子可分为组成型启动子（每种组织器官中均发挥作用）、组织特异型启动子（特定组织器官中才能发挥作用）和诱导型启动子（特定条件刺激才能发挥作用），构建基因表达载体时可单独使用某一类型的启动子也可多种类型组合使用。从减少物质和能量消耗的角度出发，最好选择__________类型启动子使马铃薯块茎在寒冷刺激下才启动抗寒基因的表达。块茎组织特异型启动子和冷刺激诱导型启动子【练一练】基因表达载体构建模式图载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种四、过程思考分析——单酶切的缺点用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段重组质粒abcda、b、c、d四个黏性末端相同。限制酶切割DNA连接酶连接启动子方向目的基因转录方向缺点1：在DNA连接酶的作用下，质粒自身环化。abcd限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接思考分析——单酶切的缺点缺点2：在DNA连接酶的作用，目的基因自身环化。abcd限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接思考分析——单酶切的缺点abcd限制酶切割DNA连接酶连接反向连接重组DNA缺点3：在DNA连接酶的作用，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。思考分析——单酶切的缺点abcd限制酶切割DNA连接酶连接缺点1缺点2缺点3反向连接重组DNA质粒自身环化目的基因自身环化思考分析——单酶切的缺点用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段重组质粒限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd黏性末端a与相同；黏性末端b与d相同。思考分析——双酶切思考分析——双酶切限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd质粒不会重新环化目的基因不会被环化优点1优点2优点3目的基因与质粒不会发生反向连接确保目的基因与载体定向连接，减少重组杂物。习题巩固——用限制酶切割时需注意的事项(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是为了

。但是使用该法缺点是容易发生

以及

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。产生相同的黏性末端，便于连接目的基因与质粒反向连接目的基因、质粒的自身环化分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体(2)获取一个目的基因需限制酶切割

次,

共产生

个游离的磷酸基团。两4习题巩固——用限制酶切割时需注意的事项(3)选择限制酶切割位点的基本原则：①切割目的基因时：