药物的含量测定方法与验证

关于药物的含量测定方法与验证基本要求

一、掌握定量分析方法验证的效能指标。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。三、了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分析中的应用。第2页,共57页，星期六，2024年，5月含量测定：

药物的含量测定系指运用化学、物理化学或生物学的方法测定药物中主要有效成分的含量。第3页,共57页，星期六，2024年，5月第一节容量分析法（一）容量分析法的特点：常用于测定高含量或中含量组分，原料药含量测定首选比较准确（相对误差＜0.2%）；操作简单、快速；仪器普通易得；第4页,共57页，星期六，2024年，5月（二）有关计算

1.滴定度（T）：每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量(mg)2.滴定度的计算

aA（待测物）

+bB（滴定液）

cC+dD

ab

T/M

1·m

T=m×a/b×Mm：滴定液浓度(mol/L)M：被测物分子量第5页,共57页，星期六，2024年，5月3.百分含量的计算（1）直接滴定法设至终点时，消耗滴定液体积为Vml则药物实测质量为V·T浓度校正因子W：供试品取样量

第6页,共57页，星期六，2024年，5月（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法）

药物+A（定、过量）→················剩余的A+B→·······（回滴）······V

空白试验···········································V0第7页,共57页，星期六，2024年，5月光谱

光谱分析法

分光光度法

分类

紫外-可见分光光度法

红外分光光度法

原子吸收分光光度法

荧光分光光度法

火焰光度法第二节分光光度法第8页,共57页，星期六，2024年，5月

二、光谱分析法

（一）紫外-可见分光光度法

吸收光谱范围：紫外：200～400nm

可见：400～760nm灵敏度高，可达10-4g/ml-10-7g/ml1.特点准确度高，RSD（%）为2%-5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用广范2.朗伯-比耳定律A=ECL

吸收系数：摩尔吸收系数ε——研究分子结构百分吸收系数Ｅ——含量测定第9页,共57页，星期六，2024年，5月3.仪器的校正和检定

波长的校正：汞灯中的几根较强的谱线或用仪器自身所带的氘灯的特定谱线为参照进行校正吸收度准确性的检定：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波长处测定Ｅ，应符合规定杂散光的检查：一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液，规定波长处测定透光率，应符合规定第10页,共57页，星期六，2024年，5月

4.对溶剂的要求:含杂原子的有机溶剂通常具有很强的末端吸收它们的使用范围均不能小于截止使用波长石英吸收池、空气为空白

λ(nm)溶剂+吸收池A220～240≤0.40241～250≤0.20251～300≤0.10300以上≤0.05第11页,共57页，星期六，2024年，5月5.测定方法

要求供试品溶液的A应在0.3～0.7

1）对照品比较法：A供／A对＝C供／C对原料药：制剂：第12页,共57页，星期六，2024年，5月2）吸收系数法：注意：应>100应注意仪器的校正和检定：作为计算浓度的因数进行定量的方法，不是任何情况下都适用的，特别时单色光不纯的情况下，A会随仪器不同而变化，误差较大但若认定一台仪器，固定其工作状态和测定条件，则C和A间的关系在多数情况下仍符合Lambert－Beer定律

第13页,共57页，星期六，2024年，5月3）计算分光光度法：方法有多种，具体按每种药物规定的方法进行。如：VA的三点校正法4）比色法

加入显色剂后，按照对照品比较法测定影响显色因素很多，故需注意平行操作空白溶剂：溶剂+显色剂，同法处理第14页,共57页，星期六，2024年，5月

（二）荧光分析法

灵敏度高，可达10-10g/ml～

10-12g/ml

在低浓度进行测定，防止自熄灭作用1.特点用基准溶液代替对照液校正仪器灵敏度制备荧光衍生物，可提高灵敏度和选择性

干扰因素多，需做空白实验样品用量少，操作简单，应用范围较广

第15页,共57页，星期六，2024年，5月2.含量测定

原理：当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧光强度R与该物质浓度C成正比

方法：对照品比较法计算：第16页,共57页，星期六，2024年，5月

第三节色谱法

根据混合物中各组分的色谱行为差异，先行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析的方法，是分离分析混合物的最有力手段。

按分离原理：吸附；分配；离子交换；空间排阻分类

按分离方法：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC

特点：高灵敏度、高效能、高速度、应用广泛第17页,共57页，星期六，2024年，5月（一）HPLC法

1.对仪器一般要求

固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变其他均可适当改变色谱图20分钟内记录完毕

2.系统适用性试验

色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)2分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);应大于1.5重复性：对照液连续进样5次，峰面积RSD≤2.0％拖尾因子：T=W0.05h/2d1

应在0.95～1.05

第18页,共57页，星期六，2024年，5月流动相真空脱气机四元泵自动进样器柱温箱紫外检测器蒸发光散射检测器第19页,共57页，星期六，2024年，5月液质联用仪质谱检测器第20页,共57页，星期六，2024年，5月流动相：对于以C18为固定相的反相色谱系统，常用甲醇-水，间或加以乙腈、缓冲液等为流动相，有机溶剂比例通常不低于5％第21页,共57页，星期六，2024年，5月四元泵第22页,共57页，星期六，2024年，5月自动进样器第23页,共57页，星期六，2024年，5月色谱柱填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶第24页,共57页，星期六，2024年，5月检测器第25页,共57页，星期六，2024年，5月测定方法1)内标法加校正因子测定供试品中主成分含量峰面积含量对照液（R）：ARCR

内标液（S）：ASCS供试液（X）：AXCXf=————AS/CSAR/CRf=————A’S/C’SAx/CxCx=f·————

AxA’S/C’S第26页,共57页，星期六，2024年，5月2)外标法测定供试品中主成分含量对照液（R）：ARCR

供试液（X）：AXCX要求：进样量准确、操作条件稳定CXCRAXAR——＝——CX＝————CR·AXAR第27页,共57页，星期六，2024年，5月

（二）GC法1.对GC仪器一般要求

载气：氮气色谱柱：填充柱或毛细管柱填充柱：内径2～4mm，长1～10m，内装吸附剂高分子多孔小球或涂渍固定液的载体毛细管柱：内径0.2～0.5mm，长10～100m，一般为空心柱，内壁或载体经涂渍或交联固定液检测器：氢火焰离子化检测器色谱图：30分钟内记录完毕

2.色谱适用性实验：同HPLC

3.测定法：同HPLC第28页,共57页，星期六，2024年，5月

第四节药品分析方法验证

目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。

起草药品质量标准生产工艺变更制剂组分改变原分析方法修订验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性均需对分析方法进行验证第29页,共57页，星期六，2024年，5月一、准确度（accuracy）：测量值与真实值接近的程度表示:回收率测定方法：回收试验

加样回收试验第30页,共57页，星期六，2024年，5月含量测定方法的准确度

1.原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较

2.制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响

①用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药②向制剂中加入已知量的被测物进行测定

③与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较具体做法：

测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%～102%；容量法可达99.7%～100.3%第31页,共57页，星期六，2024年，5月二、精密度（precision）：定义:

同一样品多次测量值之间相互接近的程度表示：偏差，标准偏差,相对标准偏差

1.偏差(deviation,d)

d=测得值-平均值=Xi-X2.标准偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.

相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)

RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X×100%

第32页,共57页，星期六，2024年，5月重复性:

同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:

同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度重现性:不同实验室，不同人测定的精密度数据要求均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限第33页,共57页，星期六，2024年，5月三、专属性（specificity）:指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性（鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性）

1.鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应第34页,共57页，星期六，2024年，5月

2.含量测定和杂质测定

色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。

图中注明各组分位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。第35页,共57页，星期六，2024年，5月

四、检测限（limitofdetection，

LOD)

是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。1.目视法用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色鉴别法，TLC2.当用GC和HPLC法时，一般以S/N＝2或3时的相应浓度来确定检测限。第36页,共57页，星期六，2024年，5月

五、定量限（1imitofquantitation，

LOQ)

是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。常用信噪比法确定定量限。一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。第37页,共57页，星期六，2024年，5月

六、线性（linearity）

是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或量直接呈正比关系的程度。回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少5份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图，建立回归方程，求出r如UV：制备一个标准系列，浓度点n=5A=0.3-0.7建立回归方程C=aA+br＞0.9999第38页,共57页，星期六，2024年，5月CA500.22750.351000.451250.581500.69AC线性的偏离………﹍﹍﹍第39页,共57页，星期六，2024年，5月七、范围

（range）

是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。

如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的80%～120%制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的70%-～130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的±20%。第40页,共57页，星期六，2024年，5月

八、耐用性（robustness）

是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。第41页,共57页，星期六，2024年，5月检验项目和验证内容：项目内容鉴别杂质测定含量测定及溶出量测定定量限度准确度＋＋精密度－＋重复性＋＋中间精密度＋①＋①专属性②＋＋＋＋检测限－③＋－定量限＋－线性＋＋范围＋＋耐用性＋＋＋①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充③视具体情况予以验证第42页,共57页，星期六，2024年，5月

第五节定量分析样品的前处理方法一、概述

1.结构特征与分析方法之间的关系①含卤素有机药物R-X（F，Cl,Br,I）卤素与芳环相连Ar-X结合牢固

卤素与脂肪链相连R-X结合较不牢固②含金属有机药物

含金属有机药物R-O-Me，有机酸或酚的金属盐/配位化合物；结合不牢固，可直接测定

有机金属药物R-Me

，结合牢固，适当处理后测定

第43页,共57页，星期六，2024年，5月

不经有机破坏的分析方法2.药物分析中常用的分析方法经有机破坏的分析方法第44页,共57页，星期六，2024年，5月二、不经有机破坏的分析方法（一）直接测定法

例如：富马酸亚铁的含量测定

终点：

邻二氮菲(+Fe3+)溶于热稀矿酸指示剂:邻二氮菲(+Fe2+)红色淡蓝色Fe3+Fe2+Ce4+第45页,共57页，星期六，2024年，5月（二）经水解后测定法

1.碱水解后测定法

适用于X与脂肪链相连的卤代烷烃例如：三氯叔丁醇的含量测定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl↓+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN↓+NH4NO3

2.酸水解后测定法

例如：硬脂酸镁的含量测定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

△三氯叔丁醇第46页,共57页，星期六，2024年，5月（三）经还原分解后测定法

适用于Ar-I的药物

例如：泛影酸的含量测定指示剂：曙红钠终点：黄→红第47页,共57页，星期六，2024年，5月

三、经有机破坏的分析方法

金属原子、卤素等与C结合牢固者，必须有机破坏

常用的有机破坏的方法有湿法破坏干法破坏第48页,共57页，星期六，2024年，5月（一）干法破坏

适用于含卤素、S、P等有机药物分析的前处理，也用于某些药物中硒及砷盐的检查。

1.高温炽灼法加无水Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或ZnO以助灰化2.氧瓶燃烧法第49页,共57页，星期六，2024年，5月

1）仪器装置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质玻璃锥形瓶2）称样固体样；液体样要求

3）燃烧分